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组织因子途径抑制物-2时间分辨荧光免疫测定方法的建立及评价

蒋芳林  
【摘要】:组织因子途径抑制物-2(tissue factor pathway inhibitor-2, TFPI-2),又称胎盘蛋白-5(placental protein 5, PP-5)或基质相关性丝氨酸蛋白酶抑制剂(matrix-associated serine protease inhibitor, MSPI),是一种带有Kunitz型结构域的蛋白酶抑制剂,属于丝氨酸蛋白酶抑制物超家族成员,可能通过影响细胞外基质的重塑参与组织发生、胚胎发育分化、伤口愈合、肿瘤的侵袭转移和动脉粥样硬化斑块破裂等生理病理过程。 TFPI-2在人血液中的浓度极低,目前常用检测方法有酶联免疫吸附法(ELISA)及放射免疫分析法(radioimmunoassay, RIA)。ELISA法影响因素较多,容易造成结果失真,灵敏度也不是非常理想。RIA法有较高的灵敏度和准确性,线性范围宽,但试剂存在放射性污染,且标记物半衰期短,试剂不易保存。 时间分辨荧光免疫分析法(time-resolved fluorescence immunoassay, TRFIA)集酶标记和同位素标记技术的优点于一身,具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽,尤其是能消除常规荧光测定中的高背景等优点,是非放射免疫分析中很有发展潜力的分析方法。 为了有助于TFPI-2的基础及临床研究,促进TFPI-2在各相关疾病防治领域的应用和发展,我们建立了TFPI-2的时间分辨荧光免疫法。该系统以抗TFPI-2多克隆抗体作为固相抗体,TFPI-2单克隆抗体(McAb) 3C8作为一抗,Eu标记的羊抗鼠单克隆抗体作为检测抗体,原核表达的重组TFPI-2作为分析的标准品。 以人TFPI-2为抗原免疫BalB/C小鼠,分离脾细胞,与骨髓瘤细胞进行细胞融合,经三次克隆筛选后,获得三株稳定分泌抗TFPI-2 McAb的杂交瘤细胞,分别命名为3C8、2F11和1C4;将三株杂交瘤细胞免疫小鼠,制备腹水,经r-protein-A亲和纯化,得到浓度约为1.5mg/ml的TFPI-2 McAb浓缩母液,SDS-PAGE纯度达98%;亲和力鉴定McAb 3C8亲和力最佳,故选其作为我们时间分辨荧光免疫分析法中的一抗;免疫球蛋白亚型鉴定显示McAb 3C8重链亚型为IgG1型,轻链亚型为k型。Western-blotting证实三株单抗均能与TFPI-2有特异性结合,免疫组织化学证实它们能够检测到正常乳腺及乳腺癌细胞表达的TFPI-2。 以人TFPI-2为抗原免疫新西兰白兔,制备抗血清,按照单克隆抗体的纯化方法纯化兔抗血清多克隆抗体,效价达1:32。以此多抗作为包被抗体,最佳的包被浓度为4ug/ml。以McAb 3C8作为一抗,最佳浓度为400ng/ml。以重组TFPI-2制作的标准曲线最佳线性范围在0.1-50ng/ml之间,相关系数为0.999,灵敏度为0.048ng/ml,批内和批间变异系数均≤8.39%。 将已制备成功的TFPI-2 TRFIA在4℃保存6个月,测定标准曲线无明显漂移,基本满足了稳定性要求。应用自制TFPI-2 TRFIA与ELISA试剂盒同时测定56例冠心病患者和24例正常对照,TFPI-2 TRFIA检测结果分别为10.58±7.12ng/ml和0.53±2.32ng/ml。ELISA检测同样样本,结果27份为负值。应用两种方法检测其它56份标本,对结果进行相关性分析,以ELISA测定值为X, TRFIA的测定值为Y,Y=1.1182x+2.4225,r=0.9363,两者有显著的相关性(P0.01)。 结论:我们建立的TFPI-2时间分辨荧光免疫测定方法比酶联免疫吸附测定法具有更好的灵敏度,特异性和稳定性符合要求,可用于判断血管及肿瘤相关疾病TFPI-2的检测。


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