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Y染色体多态性及亚甲基蓝对精子质量影响的研究

王会  
【摘要】:据世界卫生组织统计,世界上约有10%-15%的夫妇患有不育症,其中男性因素约占50%。引起男性不育的因素复杂,有遗传因素、免疫因素、生殖道感染、精索静脉曲张以及外源性因素等等。为了探讨遗传因素及外源性因素对男性不育的影响,本研究主要从Y染色体多态性与无精子因子(azoospermia factor, AZF)微缺失的相关性,亚甲基蓝(Methylene blue, MB)对精子质量及早胚发育的影响以及菁染料在精子功能检测中的应用研究几个方面进行了初步的探讨。 Y染色体AZF微缺失是男性严重少弱精和无精子症的重要原因。首先建立了含9个序列标签位点(STS)的多重PCR方法。对严重少弱精男性进行AZF微缺失筛查时发现,约有3.54%(5/141)的严重少弱精男性发生"sY84位点的单一缺失”。为探索缺失的原因,在原有的sY84引物序列的外侧设计了新的PCR引物,并对sY84基因序列进行了测序,结果发现"sY84单一位点缺失”的真正原因是sY84反向引物中的单个核苷酸由A突变为C,该突变导致多重PCR反应过程中,sY84基因片段的PCR扩增效率低,因而有时不出现特异的扩增条带,并非该位点真正的缺失(文章中统一称为AZFa-A基因型和AZFa-C基因型)。通过在NCBI上的SNP检索,发现该突变是一个编号为rs72609647的SNP。为研究该SNP的临床意义,我们根据精子密度将男性DNA样本分为3组:正常捐精组(=6千万/m1),精子密度正常组(=1.5千万/m1)和严重少精子症(500万/m1)组。对严重少精子症组的DNA样本,再通过AZF微缺失的多重PCR检测,又可分为AZF正常组和AZF微缺失组。结果发现基因型为AZFa-C的男性在所有男性人群中的发生率约为10%,而在AZF微缺失的男性患者中的发生率仅为4%,因此我们认为在用多重PCR方法对严重少弱精男性进行AZF微缺失筛查时,遇到sY84单一位点缺失的患者,需通过测序或等位基因PCR方法以排除基因多态性对微缺失结果判断的干扰;另外,我们推测AZFa-C基因型男性比AZFa-A基因型男性发生AZF微缺失的可能性小。 亚甲基蓝属于吩噻嗪类染料,由于MB对正常细胞的毒性低,近年来被广泛用于人类疾病的体内诊断和治疗,但有文献报道MB会影响精子的运动。为探讨MB影响精子运动的分子机制,本研究使用低于人体安全剂量的MB与人精子共孵育的体外实验,观察孵育不同时间后,MB对精子活力,精子质膜的影响。结果发现0.1-0.01%浓度的MB与人精子共孵育30分钟后,精子活力即发生了显著的下降,但MB对精子质膜完整性则无显著影响。用MB连续灌服大鼠14天后的结果显示,MB未影响大鼠精子的发生,也不破坏精子的质膜和精子形态,仅对精子的活力有显著影响。体内外实验均显示MB会明显抑制精子的运动,MB对精子DNA及早期胚胎发育是否也有影响?用DNA扩散实验(SCD方法)检测与0.05%MB共孵育不同时间精子的DNA完整性以及用卵胞浆内单精子注射(ICSI)方法观察与0.05%的MB孵育30分钟后小鼠精子注射进入正常卵子后的受精率。实验结果显示与MB共孵育30分钟,120分钟的精子DNA损伤指数(DFI)明显增高。而MB作用后精子ICSI后的受精率及卵裂率均有显著下降。通过以上实验,推测MB可能通过作用于精子的DNA导致精子运动的下降,并最终影响精子的授精能力。 常规的精子质膜完整性检测是用伊红染色或低渗肿胀实验,这2种方法因实验结果重复性差且只能计数有限的精子数量而限制了应用。菁染料是一种重要的功能性染料。近年来,其作为一种活细胞荧光染料,在生物领域被广泛应用。我们与西北大学化学系合作,共制备了20份带不同活性基团的菁染料(A1-A20),其中包括含吲哚核二甲川菁染料、含喹啉核二甲川菁染料和份菁染料(含异嗯唑酮核-次甲基份菁染料)。并以精子细胞为研究对象,对不同菁染料的荧光强度,荧光稳定性,对精子活力的影响程度等多个指标进行筛选,获得了4个具有膜通透性,荧光背景干扰小的染料。通过对已知结构的菁染料的生物活性实验,我们可了解菁染料的不同基团在精子活性染色中的作用,最终有望建立费用低廉,适合在国内临床推广的精子质膜完整性检测新方法。


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