应用组学方法研究孕妇血清中唐氏综合征标记物

【摘要】：唐氏综合征(Down syndrome, DS)是一种最常见的伴有智力障碍的染色体疾病,新生儿中发病率约1/800-1/600,患者生存质量极低,造成家庭和社会沉重的负担。鉴于产前诊断多有创伤性,产前筛查对预防和减少此类出生缺陷至关重要。DS遗传机制可能是由于21号染色体某一区域50-100个基因共同作用。对DS发病有重要作用的基因包括SOD1、COL6A1、ETS2、CAF1A、CBS、DYRKA1、CRYA1、GART, IFNAR、APP、GLUR5、S100B、TAM、PFKL等。虽然DS确切的发病机制尚未明了,但上述基因的过表达所引起的广泛效应是DS的主要病因。因此,我们推测是否在胎儿发育阶段已经出现21号染色体基因过表达所导致的病理生理改变。基因表达的改变可造成一些重要的生化代谢不平衡,母胎作为一个整体,势必导致孕妇妊娠过程中血清中蛋白质和代谢产物发生改变,这些蛋白质和代谢物的改变可能对产前筛查唐氏综合征有帮助。 本实验拟应用蛋白质组学和代谢组学技术研究孕妇血清中唐氏综合征相关蛋白质和代谢物。具体包括以下几个方面：iTRAQ蛋白质组学技术分析妊娠DS孕妇和正常孕妇血清蛋白质组特点之间的类似性和差异性,质谱技术鉴定蛋白质,根据定量信息得到差异蛋白质。应用生物信息学方法建立差异蛋白相互作用网络,寻找DS发病相关通路和相关蛋白质。应用代谢组学技术分析妊娠DS孕妇和正常孕妇代谢谱之间的类似性和差异性,应用模式识别技术建立小分子代谢物产前筛查模型,为产前筛查提供新思路。 第一部分应用iTRAQ蛋白质组学方法鉴定孕妇血清中蛋白质 目的：分析妊娠DS孕妇和正常孕妇血清蛋白质组学的差异性,筛选两组间的差异蛋白质。 材料和方法：从复旦大学附属妇产科医院D筛查资料库中,选取18例妊娠14-19周DS患儿孕妇血清为DS组和18例妊娠14-19周健康孕妇血清为CON组,用iTRAQ蛋白质分离技术和液相色谱质谱鉴定技术分析两组的蛋白质,按两组之间比值定量信息以DS/CON≥1.40(上调)和DS/CON0.7(下调)为显著差异的标准,得到差异蛋白质。Western blot验证差异蛋白。利用Gofact、DAVID分析工具GO数据库对蛋白质的分子功能、生物学过程分类。 结果：DS组和CON组年龄分别为30.6±4.1岁和29.3±2.2岁,孕龄分别为16.6±1.3和16.6±1.2,差异均无统计学意义。鉴定出孕妇血清中86种蛋白的相对定量信息和31种差异蛋白,经Western blot验证VDBP在两组中差异有统计学意义。差异蛋白参与细胞过程占75.9%,生物调节占72.4%,代谢过程占69%,刺激应答占58.6%：差异蛋白中17个蛋白(54.8%)具有蛋白结合功能,转运功能12个(38.7%),酶调节功能有9个(29%)。其中16种蛋白在DS组上调,15种蛋白下调。 结论：iTRAQ蛋白分离和质谱鉴定技术成功鉴定了血清中差异蛋白质。 第二部分构建差异蛋白相互作用网络 目的：在母血中寻找与DS发病相关的信号通路和蛋白质,为发现产前筛查唐氏综合征标记物打下基础。 材料和方法：DAVID分析工具对差异蛋白功能聚类分析后,利用IPA软件分析主要功能聚类中蛋白质相互作用网络、DS发病相关基因(SOD1、COL6A1、ETS2、CAF1A、CBS、DYRKA1、CRYA1、GART、IFNAR、APP, GLUR5,S100B, TAM, PFKL)的相互作用网络和差异蛋白联合经典的血清学标记物(AFP、JCG、PAPP-A、INHA)分子相互作用网络。 结果：差异蛋白的功能聚类主要是脂质运输、酶调节功能、细胞分化发育、凋亡,分别参与脂代谢、心血管系统发育、神经系统发育网络,网络枢纽为ERK信号通路。差异蛋白与经典的血清学标记物共同参与细胞生长和增殖相互作用网络,枢纽为ERK信号通路。APOE、IGFBP3、AGT、KNG1、AFM是网络中的重要蛋白质。 结论：胎儿期ERK通路的改变可能是DS神经系统和心脏受累的病理生理机制,血清中APOE、IGFBP3、AGT、KNG1、AFM与ERK通路相关,可能是产前筛查候选分子。 第三部分应用代谢组学建立产前筛查唐氏综合征模型 目的：分析妊娠DS孕妇和正常孕妇血清代谢组学谱图的差异性,建立产前筛查诊断模型。 材料和方法：选取9例妊娠14-19周妊娠DS孕妇血清为DS组,44例14-19正常孕妇血清为CON组。采用毛细管液相色谱质谱分析两组代谢谱的差异性,应用PCA、PLS-DA分析代谢谱,应用SVM产前筛查模型,筛选出差异代谢物。 结果：PCA和PLS-DA分析病例组和对照组聚类在各自的区域,区分良好。应用SVM前10位代谢物建立模型为预测率为88.9%,假阳性率为2.3%,ROC曲线面积0.933。参与预测的离子是P127.2、P213.2、P115.1、P241.5、P214.2、P110、P131.1、N470.8、P143.2、P459.5。 结论：代谢组学方法建立的产前筛查模型准确率较经典产前筛查方法高,为产前筛查提供了新的思路。