UV/H_2O_2对铜绿微囊藻抑制特性及其对微囊藻毒素降解机理研究

【摘要】：水体富营养化及其引发的有害藻类水华是我国当前主要面临的环境问题之一‘。有关有害藻类污染治理的方法和技术的研究一直以来是水污染控制领域的热点。在UV/H2O2光氧化体系中,H202光解产生强氧化剂·OH,其具有高效杀灭微生物、快速降解有机化合物的特点,因而UV/H2O2在有害水华藻类防治领域的运用潜力巨大。本论文系统地研究了UV/H2O2对水华铜绿微囊藻抑活机理及效应、UV/H2O2处理后藻胞内／外毒素变化、UV/H2O2对微囊藻毒素的降解动力学和降解机理。 本论文的主要研究如下： 1. UV/H2O2抑藻机理及抑藻效应研究 建立了水杨酸捕获法测定·OH的HPLC检测条件：流动相为20%甲醇+80%水(含0.03’M乙酸和0.03 M柠檬酸),流速为1mL/min;同时证实了UV/H2O2体系中生成的·OH参与了藻细胞的氧化损伤过程。基于藻细胞基因转录水平和生理生化指标分析得出结论,UV/H2O2对藻细胞的损伤机理主要是通过·OH氧化损伤藻细胞膜,使其发生脂质过氧化反应,进而损伤藻细胞DNA及蛋白质等生物大分子和光合作用系统。藻毒素合成相关基因的转录表达量受到UV/H2O2处理的抑制,因而UV/H2O2抑制藻生长的同时可抑制胞内毒素的合成量,从而减少释放至水体的毒素含量。 本论文同时研究了铜绿微囊藻分别经UV254、H2O2及UV/H2O2处理后继续培养过程中的生长情况,研究结果表明：H202和UV254对铜绿微囊藻生长抑制效应均随作用剂量的增加而增强；UV/H2O2对铜绿微囊藻的抑制存在明显的协同效应,在实验室条件下,0.2 mM H2O2结合38 mJ/cm2 UV254辐照剂量是抑藻效应最强的组合；结合扫描电镜分析表明,UV/H2O2处理对铜绿微囊藻细胞形态结构造成破坏。藻液经0.2 mM H2O2结合38 mJ/cm2 UV254辐照剂量联合处理后第10d,几乎所有藻细胞凹陷变形,很多藻细胞细胞壁破裂,细胞质外溢而死亡。 2. UV/H2O2抑藻过程中铜绿微囊藻胞内／外毒素变化研究 本论文结合HPLC和ESI-MS/MS技术对铜绿微囊藻905胞内毒素鉴定结果表明,胞内毒素除MCLR以外,还存在去甲基MCLR (Demethyl MCLR)。根据双电荷分子离子(M+2H)2~+m/z=491.3的MS/MS图谱初步推测Demethyl MCLR的分子结构是：[D-Asp3]mcyst-LR、[Dha7]mcyst-LR、[D-Asp3,(E)-Dhb7]mcyst-LR或者[D-Asp3,(Z)-Dhb7]mcyst-LR。对结合固相萃取(SPE)技术的藻细胞的胞内毒素提取流程进行了优化。优化后的毒素提取流程如下：离心收集纯培养藻液,于藻浆中加入w(甲醇)=75%提取液,反复冻融3次,后辅以超声破碎0.5h,离心收集上清液并过C18固相萃取柱进行富集,然后用w(甲醇)=10%淋洗液对C18固相萃取柱进行淋洗以除去杂质,最后用w(甲醇)=80%+w(TFA)=0.05%洗脱液将毒素洗脱收集。 结合对MCLR和Demethyl MCLR具有良好交叉反应性的酶联免疫试剂盒,测定并分析UV/H2O2抑藻过程中胞内胞外毒素的变化。结果表明,UV/H2O2主要通过产生的·OH迅速降解藻细胞的胞外毒素,同时通过抑制藻细胞生物量和藻毒素合成相关基因转录表达量从而减少藻细胞的胞内毒素合成量。实验结果表明,藻液在经38 mJ/cm2 UV254辐照结合0.2 mM H2O2处理后的培养过程中,藻细胞生长受到抑制,在此过程中胞内毒素逐渐释放至水体,胞外毒素逐渐增加,藻液总毒素含量基本保持不变。 3. UV/H2O2对微囊藻毒素的降解动力学研究 本论文对比研究了UV254、H2O2及UV/H2O2对MCLR的降解效率,结果表明：1)H202几乎不能氧化降解MCLR, UV254直接光解以及UV/H2O2都能较好的降解MCLRO当pH值为8.0、UV254辐照强度为1738μW/cm2、H202浓度为5mM时,第40 min三种处理对MCLR的降解效果存在明显差异,其中H202对MCLR的降解率仅为8.4%±2.1%、UV254直接光解去除率为73.6%±3.4%、UV/H2O2处理效果最好(去除率为98%±4.8%)。2)三个处理过程均能较好的拟合表观一级动力学方程,其表观一级动力学常数分别为kH2O2=0.0021 min-1、kUV=0.045 min-1和kUV/H2O2=0.082 min-1。kUV/H2O2值超过k_(H2O2)与Kuv之和,表明UV/H2O2具有明显的协同作用。 UV/H2O2对MCLR的降解过程受初始H202浓度、UV254辐照强度、MCLR初始浓度以及溶液pH值的影响。当H202在0-10mM浓度范围内,UV/H2O2对MCLR降解的表观一级动力学常数与H202浓度呈正相关关系k=-0.007×[H202]+0.0446,(R2=0.9918)；UV/H2O2对MCLR的降解效率随UV254辐照强度的提高而增加,随MCLR初始浓度的提高而降低,MCLR降解的表观一级动力学常数与MCLR初始浓度呈负相关关系：k=.0.0056×[MCLR]0+0.1771(R2=0.8528)。 此外,本论文选取硝基苯(NB)作为竞争参考物质,根据UV254光解和·OH氧化MCLR的原理和·OH稳态理论建立UV/H2O2降解MCLR的竞争动力学模型,并结合模型测定了·OH与MCLR的二级动力学常数(k=-2.8(±0.21)×1010 M-1s-1)。 4. UV/H2O2降解微囊藻毒素的中间产物及途径研究 结合LC-MS分析,基于总离子流图谱(TIC)及(M+H)~+m/z数据,结果表明UV/H2O2降解MCLR过程主要生成9种中间产物,其正离子质荷比分别为(M+H)+m/z 1029.5、(M+H)+ m+z 1011.5、(M+H)+ m/z795.4、(M+H)+ m/z835.4、(M+H)+ m/z 811.3、(M+H)+ m/z 1027.5、(M+H)+ m/z 1009.5、(M+H) + m/z 965.5和(M+H)+ m/z 1045.5. UV/H2O2降解MCLR过程中主要涉及·OH降解、氧化降解以及UV254直接光解作用。·OH主要进攻MCLR分子Adda侧链上的共轭双键、苯环及甲氧基。根据中间产物的分子量信息及·OH与多肽和蛋白质反应机理等资料信息,推测UV/H2O2对MCLR降解途径主要有3条,分别如下：1)·OH进攻Adda侧链共轭双键,通过亲电加成反应生成4,5-二羟基衍生MCLR或者6,7-二羟基衍生MCLR,然后相应的Adda侧链C4-C5双羟基键或C6-C7双羟基键氧化断裂,生成醛或酮衍生中间产物,这些中间产物进一步被氧化生成相应的羧酸衍生物；2)·OH进攻Adda侧链苯环,通过亲电取代反应生成(ortho、meta或para)苯环羟基衍生MCLR或苯环双羟基衍生MCLR,然后进一步氧化生成醛或酮衍生中间产物；3)·OH进攻Adda侧链甲氧基,通过夺氢反应生成甲酸酯衍生MCLR,然后与·OH进一步反应,生成去甲氧基MCLR (DmADDA).结合中间产物含量的时间变化过程,表明·OH攻击共轭双键及苯环的反应为主要途径,其占总反应途径的90%以上。结合UV/H2O2降解MCLR的作用机理、MCLR降解中间产物结构和已有的文献资料分析,表明UV/H2O2降解MCLR的产物毒性基本消失。