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人偏肺病毒及多种病原体致儿童急性下呼吸道感染的临床及分子流行病学特征

沈军  
【摘要】:研究目的: 采用TaqMan-MGB实时荧光RT-PCR (real-time reverse transcriptase PCR, real-time RT-PCR)检测临床样本中人偏肺病毒(human metapneumovirus, hMPV)N基因的方法,并进一步用传统RT-PCR扩增阳性样本cDNA以进行基因序列分析;用直接免疫荧光(direct immunofluorescence assay, DFA)的方法对引起儿童急性下呼吸道感染(acute low respiratory tract infection, ALRTI)的呼吸道合胞病毒(RSV),腺病毒(ADV),A、B型流感病毒(IFV),1、2及3型副流感病毒(PIV)等7种常见呼吸道病毒抗原进行检测;以了解上海地区ALRTI患儿中呼吸道病毒感染状况及hMPV在上海地区流行株的分子流行病学特点;通过对同期标本中支原体、沙眼衣原体荧光定量PCR检测结果及细菌学培养结果的调查,较清晰的揭示2006年10月至2008年2月期间本地区儿童ALRTI的病原谱构成比与变化特点。 对象及方法: 1.收集2006年10月到2008年2月确诊为ALRTI住我院48小时内共1347例的患儿深部鼻咽分泌物(nasopharyngeal secretion, NPS)1347份标本。 2.用TaqMan-MGB实时荧光RT-PCR方法检测随机挑选(每周二、四采集)的622份NPS标本中人偏肺病毒(hMPV) RNA,阳性标本进一步用传统PCR扩增产物并进行基因序列分析。荧光RT-PCR的上游引物为5'-CATCAGGTAATATCCCACAAAATCAG-3',下游引物为5’-GTGAATATTAAGGCACCTACACATAATAA-3',探针为FAM-5’-TCAGCACCAGACACAC-NFQMGB-3';测序传统PCR的上游引物为5’-AACCGTGTACTAAGTGATGCACTC-3',下游引物为5’-CATTGTTTGACCGGCCCCATAA-3'。 3.用直接免疫荧光法方法检测1347份NPS中的呼吸道合胞病毒(RSV),腺病毒(ADV),A、B型流感病毒(IFV),1、2及3型副流感病毒(PIV)抗原。 4.对各种病毒在小儿ALRTI中所占比例、性别、年龄、季节分布及临床特点进行临床流行病学分析,并对hMPV检测及测序结果进行分子流行病学分析。基因序列分析用BLAST和DNAMAN软件对hMPV核苷酸序列作比较,并绘制基因进化树。 5.调查同期标本中支原体、衣原体荧光PCR检测结果及细菌学培养结果。 结果: 1. TaqMan-MGB实时荧光RT-PCR检测hMPV基因共检测出24份阳性标本,检出率为3.86%,阳性样本cDNA用另一对引物进一步用传统RT-PCR扩增,16份标本阳性;随机选取5份传统RT-PCR产物进行测序,测得的核苷酸序列经过BLAST比较,与GeneBank中已知hMPV序列的同源性在84%~100%之间;用DNAMAN软件进行基因分析发现,5份样本序列在进化树中聚类为2簇;5份样本基因序列变异性可表现为核苷酸的点突变,也可是临近几个碱基同时突变,甚至有单个或临近几个碱基的核苷酸缺失及插入突变。 2.622例患儿中,3月龄以下儿童hMPV检出率0.94%(2/213),3月龄到6足月以下儿童检出率3.95%(3/76),6月龄到1足岁以下儿童检出率2.73%(3/110),1岁到2足岁以下儿童检出率9.52%(6/63),2岁到5足岁以下儿童检出率6.98%(9/129),5岁以上儿童检出率3.23%(1/31)。2岁以下儿童占58.33%(14/24),5岁以下儿童占95.83%(23/24)。hMPV致ALRTI绝大多数在11月份到次年1月份之间(21/24)。2006-2007年冬季hMPV检出率6.60%(14/212),2007-2008年冬季hMPV检出率1.11%(2/180)。男性323例患儿中检测出hMPV阳性10例(3.10%),女性237例患儿检出hMPV阳性14例(5.91%),男女检出率无差异(X2=2.63,P0.05)。 3.1347份标本中7种常见病毒共检出率为33.56%(452/1347),hMPV检出率为3.86%(24/622),总的病毒检出率35.19%(474/1347);细菌检出率为24.64%(329/1335),支原体和衣原体检出率分别为7.85%(103/1312)和2.97%(39/1312),1347份标本总的病原学检出率为55.23%(744/1347),其中混合感染率为15.59%(210/1347),2份标本hMPV与RSV同时阳性,9份标本存在3种病原体同时感染。有44.77%的临床标本病原未明。 4.RSV检出率为28.36%(382/1347),为最常见的感染原。2006-2007年冬季RSV检出率31.16%(124/398),2007-2008年冬季RSV检出率38.59%(120/311);2007年春季、夏季、秋季RSV检出率分别为21.05%(36/171)、8.64%(7/81)和31.40%(92/293)。2岁以下儿童为RSV最易感人群。3月龄以下儿童检出率36.36%(184/506),3月龄到6足月以下儿童检出率31.58%(72/228),2岁以下儿童占91.88%(351/382),5岁以下儿童占98.69%(377/382)。RSV阳性患儿多有喘息表现。 5.PIV检出率为2.82%(38/1347),低于RSV和hMPV;ADV检出率为1.86%(25/1347);IFV检出率为1.19%(16/1347);少见混合性病毒感染。 6.支原体和衣原体检出率分别为7.85%(103/1312)和2.97%(39/1312)。支原体在5岁以上儿童中的检出率为34.5%,衣原体在3月龄以下儿童中的检出率为6.8%。 结论: 1. TaqMan-MGB实时荧光RT-PCR检测hMPV基因具有快速、操作简便、敏感度高的特点,可应用于临床检测。2006年10月至2008年2月本地区存在两种基因型hMPV流行。 2.2006年10月至2008年2月上海地区ALRTI儿童NPS中hMPV的检出率为3.86%,2006-2007年冬季较2007-2008年冬季检出率高。hMPV所致儿童ALRTI以5岁以下小年龄儿童多见。 3.病毒病原在本地区儿童ALRTI中占有重要地位;2岁以下儿童ALRTI以病毒性感染为主,2岁以上到5岁以细菌性感染为主,到5岁以上则以支原体感染占优势。3月龄以下衣原体有6.28%的检出率,值得关注。 4.2岁以下儿童为RSV最易感人群;在本地区,2007-2008年冬季较2006-2007年冬季RSV有较强的流行;RSV感染更易表现有喘息症状。 5.2006年10月至2008年2月本地区儿童ALRTI中,8种病毒检出率为35.19%,细菌检出率为24.64%,支原体和衣原体检出率分别为7.85%和2.97%,仍有44.77%的临床标本病原未明。


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