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CA125升高患者的良恶性鉴别方法研究

王宜生  
【摘要】:癌抗原125(cancer antigen125,CA125)是妇科最常用的血清肿瘤标志物。约80%的上皮性卵巢癌患者血清CA125水平升高。血清CA125水平能够很好的反应机体肿瘤负荷,因此是卵巢癌治疗后的主要监测随访指标。但除了卵巢癌,血清CA125水平在许多其他良恶性疾病中也会异常升高。约1%的健康女性、6%的妇科良性疾病患者会出现血清CA125水平的升高。有研究者对一综合医疗中心的血清CA125水平大于65U/ml的患者进行分析,发现74.3%的患者是妇科恶性肿瘤患者,10.2%为非妇科恶性肿瘤患者,另外13.1%为良性疾病患者。因此,CA125升高意义不明经常导致患者的诊疗方案制定困难,并且给良性疾病患者带来不必要的精神负担。如果能找出良性来源和恶性来源CA125分子结构之间的差异将能够对CA125分子进行分型,从而提高其诊断准确性。 目前对CA125分子结构的了解已经比较清晰。CA125是一种高度糖基化的粘蛋白。糖链部分约占整个分子质量的20%-70%。CA125分子经酶切从细胞膜表面脱落进入体腔或入血,成为游离CA125。CA125在成人组织中分布包括,苗勒氏管上皮,即输卵管内膜、子宫内膜(包括增生期、分泌期和孕期)以及宫颈内膜;腹膜、胸膜以及心包膜等间皮组织;支气管上皮,支气管粘膜下腺;以及角膜和结膜上皮。正常情况下,血清CA125由这些组织合成脱落入血而形成,并处于低水平。在卵巢癌患者中,癌组织能够表达高水平的CA125,并且组织表达水平与血清水平呈正相关。因此,我们推测卵巢癌患者血清中的CA125主要来源于癌组织。而在良性疾病情况下,CA125主要由腹膜、胸膜等间皮组织以及女性生殖器官粘膜等非恶性组织合成。因此,良恶性疾病中CA125具有不同性质的来源。 大量研究证明,恶性肿瘤常伴随着糖链合成、降解以及连接相关分子的异常改变,从而导致蛋白的异常糖基化状态。例如,肝癌中AFP的核心岩藻糖修饰增加,因此检测核心岩藻糖修饰的AFP所占的比例能够区分肝癌和慢性肝硬化,提高肝癌的早期诊断率。目前在卵巢癌中也已经发现多种糖基化修饰相关蛋白的表达异常,如浆液性卵巢癌中唾液酸转移酶ST3Gal-Ⅲ、ST3Gal-Ⅳ和ST3Gal-Ⅵ表达下调,而ST3Gal-1和ST6Gal-1表达上调;黏液性卵巢癌中N-乙酰葡糖胺转移酶GnT-V表达上调。另外,卵巢癌组织中多种糖蛋白的糖基化状态改变也被证实。 因此,我们推测恶性来源的CA125与其他良性疾病或生理状况下的CA125存在不同的糖基化状态,并且这一糖基化差异能够被用于CA125的进一步分类,从而鉴别良恶性CA125升高患者。 虽然人们很早就认识到糖链结构生物学意义的重要性,但由于糖链结构的复杂性和检测技术的限制,使得对其含义的解读一直滞后于基因和蛋白质。目前对糖链结构的分析主要基于质谱技术和以凝集素为基础的分析技术。两种方法各有利弊。质谱技术是基于分子碎裂片段的质荷比对分子结构进行推测。它能够得到蛋白质的氨基酸序列、糖链组成以及糖基化位点等信息。但质谱分析不适合于分析含量低,结构不稳定的分子。另外质谱分析对仪器、分析人员水平有很高的要求,常规实验室很难达到。凝集素分析技术是利用凝集素与特异糖链结构的结合以达到糖链结构及其含量推测的目的。由于凝集素与糖抗原的结合类似于抗原抗体反应,因此它所识别的糖链结构大多位于分子表面。这些结构也恰好是糖链参与免疫识别等生物识别的关键位点,所以对生物功能分析更有意义。凝集素对于糖链的空间构型、连接方式都有一定专一性,因此所得糖链空间结构信息更精细。但凝集素技术所得到的信息只是此种糖抗原的含量,而无法得到其定位等信息,因此在修饰位点分析方面弱于质谱分析。除此之外,凝集素相关技术的检测技术难度较低,易于在普通实验室开展。 本研究拟建立适于CA125糖基化状态检测的抗体-凝集素ELISA法,对血清CA125水平升高的妇科良恶性疾病换者CA125糖基化状态进行检测,寻找恶性肿瘤特异性CA125糖链结构,评价其用于鉴别良恶性CA125升高的能力。 第一部分旨在建立适于CA125糖基化状态检测的抗体-凝集素ELISA法。抗体-凝集素ELISA法是通过包被抗体捕获样品中的抗原,继而利用凝集素对抗原表而糖链结构进行检测。由于抗体本身有糖基化修饰,因此我们首先利用高碘酸钠对抗体糖链进行氧化,继而对其衍生化,达到封闭抗体糖链的目的。封闭后抗体上的大部分凝集素识别糖链信号被清除,使检测背景信号明显降低。为证明凝集素是通过识别CA125表面糖链产生的显色信号,我们首先通过单糖抑制试验证明显色信号是由凝集素对糖链的识别产生的,之后我们通过梯度掺入CA125证明显色信号强度与CA125含量是呈正相关的。最终确定5种凝集素:BPL. PNA、SBA、UEA、VVA能够用于建立抗体-凝集素ELISA法。 第二部分旨在使用已建立的抗体-凝集素ELISA法检测血清CA125升高的妇科良恶性疾病患者其CA125糖基化状态,寻找恶性肿瘤特异性CA125糖链结构,评价其用于鉴别良恶性CA125升高的能力。使用第一部分筛选出的五种抗体-凝集素ELISA法检测血清CA125糖基化水平,结果五种凝集素所识别糖链结构在恶性肿瘤来源的CA125中都呈高表达,其中VVA所识别的Tn抗原在两组间差异最明显。因此,我们构建了以CA125抗体X325为包被抗体,识别Tn抗原VVA为检测凝集素的抗体-凝集素ELISA法(简称为CA125/Tn ELISA),用于鉴别良恶性CA125升高患者。首先,我们使用对91例血清CA125水平大于35U/ml的患者进行检测。结果显示,CA125/Tn ELISA用于诊断恶性肿瘤来源CA125的AUC值为0.83。当取截断值为0.2时,CA125/Tn ELISA诊断恶性CA125升高的灵敏度和特异度分别为82.5%和74.5%。之后,我们对妇产科专科医院和综合医院妇产科入组的26例CA125大于1OOU/ml的初治患者进行检测。以0.2为界值,CA125/Tn ELISA的阳性预测值为30%,阴性预测值为93.8%。 综上所述,CA125/Tn ELISA是一种稳定而有效的良恶性CA125升高鉴别方法。


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