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尿路致病性大肠埃希菌持留相关机制的研究

秦晓华  
【摘要】:细菌感染治疗领域,目前面临以下两大问题。一方面,全球抗菌药物使用负荷不断增大,不合理应用甚至滥用抗菌药物现象突出,日益严峻的细菌耐药性问题成为全球关注的焦点。细菌耐药性往往由于存在某些耐药基因或固有基因发生突变而引起,细菌不仅可将耐药性遗传给子代细菌,而且可通过基因水平转移而造成耐药性的广泛播散。耐药细菌引起的感染已构成抗感染治疗的新挑战,人们正逐渐陷入“无药可用”的窘境。另一方面,临床细菌感染治疗过程中发现,某些病原菌,体外药敏试验显示对抗菌药敏感,但在体内可耐受药物的抗菌作用,并可躲避宿主的免疫防御体系,在宿主体内长期存在,难以被彻底清除,成为持续感染、慢性感染或反复发作性感染的“原凶”,比如结核病,葡萄球菌菌血症,尿路致病性大肠埃希菌(Uropathogenic Escherichia coli, UPEC)引起的反复发作性尿路感染等,这一问题又带来“有药无效”的困惑。 对抗菌药物敏感的细菌难以被清除的这一特性称之为持留(persistence)。广义而言,与细菌粘附相关的致病因子、生物膜的形成以及形成持留菌(persister)等因素,使得细菌难以被清除,均称为“持留”。狭义的“持留”则是特指持留菌能耐受高浓度抗菌药物以及各种环境应激因素而存活的能力。基因型完全相同的菌群中的很少一部分细菌亚群能耐受大剂量抗菌药物作用而存活下来,而在脱离抗菌药物的环境后又可繁殖,这一细菌亚群的子代仍保持对该抗菌药物的敏感性,这些存活下来的细菌称之为持留菌。本文题目中的“持留”取其广义含义,主要包括与粘附因子相关以及与phoU基因相关的持留。 尿路感染(Urinary tract infection, UTI)是最常见的感染性疾病之一,女性发病率远高于男性。据统计,60%女性一生至少发生一次尿路感染,而25%急性膀胱炎的患者可反复发作。大肠埃希菌是尿路感染最常见的病原菌,70-95%的社区获得性尿路感染和约50%的医院获得性尿路感染都由UPEC引起。在众多致病因子中,粘附因子被认为与UPEC难以被清除有关。UPEC的粘附因子种类繁多,主要包括1型菌毛、P型菌毛、S/F1C菌毛、Afa/Dr粘附因子家族,以及某些与生物膜形成相关的粘附因子等。其中Afa/Dr粘附因子Afa可通过与泌尿道上皮细胞表面特异性受体的相互作用,介导细菌进入宿主细胞内,躲避宿主对细菌的清除和部分抗菌药物的杀菌作用;而进入胞内的细菌可大量繁殖,随着泌尿道上皮更新脱落,胞内大量细菌释放,从而引起尿路感染再次发作,故认为携带afa基因的UPEC容易引起尿路感染的反复发作。而粘附因子PapG,由于其受体主要分布于肾脏,有研究认为其主要与急性肾盂肾炎关系密切。flu基因编码的粘附因子Ag43主要参与生物膜的形成,从而亦可使菌体难以被清除。 除了粘附因子外,UPEC持留菌的形成,亦是病原菌难以被清除的一个重要方面。关于细菌形成持留的机制,至今尚不明确,目前普遍认为是与持留菌低代谢状态有关。2007年有研究在大肠埃希菌W3110菌株中发现了与持留相关的新基因——phoU,插入突变使该基因失活后,突变株能量代谢相关基因的表达上调,细菌处于高代谢状态,而对许多抗菌药物以及各种应激状态的持留能力明显下降,突变恢复后,菌株持留能力得以恢复。本课题组比对已公布的UPEC菌株phoU基因序列与野生株W3110phoU基因序列发现:W3110phoU第236位氨基酸为甘氨酸G,而UPEC菌株,包括UTI189与CFT073、536等的phoU第236位突变为谷氨酸E。本课题第三部分探讨该氨基酸位点的突变对UPEC持留能力的影响。 基于上述研究背景,本课题收集华山医院2008年1月至2009年12月尿路感染住院患者分离培养的UPEC47株,以及从健康志愿者肛拭子标本培养分离大肠埃希菌26株,进行菌株耐药性、同源性分析、粘附因子基因以及phoU基因相关持留机制的研究,探索临床尿路感染反复发作,UPEC菌株难以清除的机制;为开发新型尿路感染治疗药物提供理论基础。本研究内容包括以下三部分。 第一部分UPEC临床株与肠道定植大肠埃希菌药物敏感性试验与同源性分析 我们收集了2008年1月至2009年12月住院尿路感染患者尿液标本中分离的47株UPEC,并从健康志愿者肛拭子标本分离培养26株肠道定植大肠埃希菌作为对照。用琼脂稀释法测定哌拉西林、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、亚胺培南、美罗培南、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、左氧氟沙星和呋喃妥因等15种抗菌药物对两组菌株的最低抑菌浓度(Minimal Inhibitorty Concentration, MIC)。根据2010年版CLSI (Clinical and Laboratory Standard Institute)药敏判断标准判定结果,统计两组菌株对各种抗菌药物的敏感率和耐药率。 药敏结果显示,UPEC对大多数抗菌药物的敏感性明显低于肠道定植E.coli菌株(P0.05)。特别是对于临床常用的氟喹诺酮类药物(环丙沙星和左氧氟沙星),UPEC的敏感率仅为23%,而肠道定植菌株的敏感率为96%;而对头孢噻肟,UPEC的敏感率仅为32%,而肠道定植菌为89%。但对哌啦西林/他唑巴坦、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星和呋喃妥因等药物,UPEC仍有较高的敏感率(敏感率均在89%-100%之间)。 根据2009年CLSI的规定,对头孢噻肟MIC≥4μm/m1,头孢他啶MIC≥16μg/ml的菌株,用CTX和CTX/CV,或CAZ和CAZ/CV双纸片进行产ESBLs菌株确证试验。结果47株UPEC中产ESBLs菌株为28株(60%),而在26株肠道定植大肠埃希菌菌株中发现1株产ESBLs菌株(4%)。产ESBLs菌株对头孢噻肟的耐药率为100%,而对头孢他啶的耐药率为50%。用PCR方法对28株UPEC菌株进行bla-CTX-M分型,其中14株(50%)属于CTX-M-1组,12株(43%)属于CTX-M-9组,CTX-M-1组菌株对头孢他啶的耐药率(86%)显著高于CTX-M-9组(17%)。 从大肠埃希菌MLST分型官方网站查询并获取七个管家基因adk、fumC、 gyrB、icd、mdh、pur A和recA的引物序列和PCR实验方案,扩增47株UPEC菌株和26株肠道定植菌株上述7个管家基因片段,比对获取等位基因编码及ST型别,用eburst软件分析菌株同源性并作图。除5株UPEC和4株肠道定植大肠埃希菌同属ST10型以及1株UPEC和1株肠道定植大肠埃希菌同属ST453外,其他UPEC菌株MLST分型与肠道定植大肠埃希菌菌株完全不同。本研究47株UPEC菌株中最多见的ST型为国际流行大肠埃希菌株ST131型(9株,19.1%),其次依次为ST405(7株,14.9%),ST10(5株,10.6%),ST393(4株,8.5%),ST69(4株,8.5%)以及ST95(3株,6.4%)。26株肠道定植大肠埃希菌菌株来自于22个不同ST型,分布更为分散,其中18个ST型在大肠埃希菌MLST官方网站资料库已有记录,另发现4个新的ST型。ST10型在肠道定植大肠埃希菌中最为常见(4株,15.4%),其次为一新发现ST型(2株,7.7%),其余20株均属于20个不同的ST分型。 第二部分UPEC与正常人肠道定植大肠埃希菌粘附因子相关基因分析 根据患者临床资料,47株UPEC菌株分为反复发作性下尿路感染组(21例)、急性肾盂肾炎组(7例)和急性单纯性膀胱炎组(19例)。用PCR方法检测三组UPEC菌株以及健康志愿者肠道定植大肠埃希菌粘附因子基因afa、dra、daa、 papG、flu、fimH、sfa和focG的携带情况。 ①共有6株UPEC菌株afa基因阳性,且该6株UPEC均属于反复发作性下尿路感染UPEC菌株组(29%),在健康人肠道定植大肠埃希菌菌株未检测到afa基因携带株(P=0.004)。在所有实验菌株中均未发现携带draE或daaE基因的菌株。②47株UPEC菌株中11株(23%)papG基因阳性,其中10株为papGⅡ型,1株为papGⅢ型,另有1株肠道定植大肠埃希菌为papGⅡ型。papG基因在急性肾盂肾炎UPEC中的检出率达71%,显著高于反复发作性下尿路感染组(14%)和急性单纯性膀胱炎组(16%)(P=0.005)。③80.9%UPEC菌株与50.0%肠道定植菌株生物膜相关粘附因子flu基因阳性(P=0.006)。但3组UPEC菌株flu基因携带率无显著差异。@UPEC中fimH基因检出率为89.4%,而肠道定植菌株则为76.9%(P=0.155)。⑤反复发作性下尿路感染组、急性肾盂肾炎组和单纯性膀胱炎组UPEC菌株中各有一株为sfa基因阳性,其中有一株同时携带有focG基因。而健康中肠道定殖大肠埃希菌未检测到sfa/foc基因。 UPEC菌株携带粘附因子基因数多于肠道定植大肠埃希菌。76.6%的UPEC菌株携带2-3种粘附因子基因,而80.8%的肠道定植大肠埃希菌携带1-2种粘附因子基因。有1株(2.1%)UPEC菌株携带5种粘附因子基因,1株(2.1%)携带4种,但也有2株UPEC(4.3%)未检测到粘附因子基因。 产ESBLs UPEC菌株携带粘附因子数少于非产ESBLs菌株。28株产ESBLs UPEC菌株中有2株(7%)未检出任何粘附因子,6株(21%)检出1种粘附因子,15株(54%)携带2种粘附因子,4株(14%)携带3种粘附因子,另有1株(4%)有4个粘附因子基因为阳性。而19株不产ESBLs UPEC菌株,仅含1种粘附因子基因的菌株为1株(5%),分别有8株(42%)和9株(47%)携带2种和3种粘附因子基因,另有1株(5%)含有5种粘附因子基因。故产ESBLs UPEC菌株的大多数(80%)所含粘附因子数目不多于2种,而超过一半(52%)的不产ESBLs UPEC菌株携带至少3种粘附因子基因(P=0.012)。 第三部分UPEC临床分离株phoU基因相关持留机制研究 为研究临床分离UPEC菌株phoU基因相关持留机制,本部分研究首先用PCR方法扩增比对47株UPEC临床分离株和26株肠道定植大肠埃希菌phoU基因全长序列。47株UPEC菌株中10株(2l%)为phoU基因野生型(同W3110),37株(79%)phoU基因为突变型,其中20株为phoUG236E突变型(同CFT073、UTI89等UPEC菌株),而17株为phoUS239P+D240K+K241E突变型。而26株肠道定植大肠埃希菌均为phoU基因野生型。 UPEC菌株MLST型别与phoU基因型存在相关性。9株ST131UPEC菌株均为phoUG236E突变型,7株ST405和4株ST393UPEC菌株均为phoUS239P+D240K+K241E突变型,而5株ST10UPEC菌株则均为phoU基因野生型。另外,papG基因阳性菌株均为phoU突变型,且phoU突变型UPEC菌株所携带的粘附因子基因数多于phoU基因野生型UPEC菌株。但phoU基因型不同的UPEC菌株在引起尿路感染的类型和对主要抗菌药物的敏感性等方面无明显差异。 为进一步了解phoU基因突变型,尤其是phoUG236E突变型UPEC菌株与phoU野生型UPEC菌株持留能力的差异,本研究用杀菌试验的方法,研究phoUG236E突变型UPEC菌株与phoU野生型UPEC菌株,在三种抗菌药物头孢他啶、阿米卡星和环丙沙星较高浓度作用下的持留情况。①头孢他啶2×或4xMIC作用30小时后,phoU野生型UPEC菌落计数降至0,而phoUG236E突变型菌落计数仍有1-5×101CFU/ml;改用8×MIC头孢他啶作用,在实验观察时间(56h)内phoUG236E突变型和phoU野生型菌株均能被杀灭,但phoUG236E突变型UPEC菌株被完全杀灭所需时间(44h)明显长于phoU野生型UPEC菌株(20h)。②阿米卡星4xMIC作用20h后,完全杀灭phoU野生型UPEC菌株,而phoUG236E突变型UPEC菌落计数仍有1-7.5×101CFU/ml;增加药物浓度至8xMIC,phoUG236E突变型UPEC亦能被完全杀灭,但时间(30h)明显较phoU野生型(4h)延长。③环丙沙星8×MIC作用30h后,phoU野生型UPEC被杀灭完全,而phoUG236E突变型仍有1-3.5×101CFU/ml;而增加药物浓度于16xMIC,phoUG216E突变型可在药物作用44h后被完全杀灭,而在药物作用后4h,phoU野生型UPEC菌落计数已降为零。所以,在抗菌药物作用下,phoUG236E突变型UPEC菌株的持留能力较phoU野生型UPEC菌株持留能力增加。 为进一步探讨在抗菌药物作用下,phoUG236E突变型UPEC菌株的持留能力较phoU野生型UPEC菌株持留能力增加的机制,本研究用相对荧光定量PCR的方法测定在抗菌药物作用下phoUG236E突变型和phoU野生型UPEC菌株phoU基因相对表达量(以管家基因mdh为内参基因)。结果显示:4×MIC头孢他啶、4×MIC阿米卡星和8×MIC环丙沙星作用12h后,phoUG236E突变型UPEC菌株phoU基因相对表达量是phoU野生型UPEC菌株的6.2、20.6和6.8倍,即在上述三种抗菌药物作用下,phoU G236E突变型phoU基因表达量水平均相对更高。上述结果提示可能由于phoU G236E突变型在抗菌药物作用下phoU表达量较phoU野生型UPEC菌株高,从而增强前者的持留能力,但具体机制仍不明确。


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