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微流控LAMP芯片的研究及在生物分子床边快速检测中的应用

方雪恩  
【摘要】:本论文工作创造性地结合环介导等温核酸扩增和微流控芯片技术,以特异保守基因分子标签为检测对象,建立了单重、多重、定性、定量和集成LAMP微流控芯片,并成功应用于猪伪狂犬病毒,甲型流感病毒和肺结核杆菌等重大传染性病原体的快速诊断和分型。 本论文工作利用同源分析软件Vector NTI,借助美国基因数据库Genbank,搜寻得到猪伪狂犬病毒(DNA结合蛋白基因),甲型流感病毒(红细胞凝素酶编码基因)和肺结核杆菌(Gyr B蛋白编码基因)的特异性基因分子标签;利用Primer ExplorerV3软件成功设计各分子标签的LAMP探针;通过单因素试验确立了最佳LAMP反应体系;通过微机电加工技术和软光刻技术制作各种LAMP微芯片模块。 1)单重定性/定量LAMP微芯片的反应槽长10mm,宽0.6mm,深0.8mm,容纳体积约5μL,利用PDMS材料的生物友好性、材质气密性和高透光性成功实现了LAMP扩增和结果直接肉眼判定。通过整合穿透式微型光纤,实时监测芯片LAMP反应阳性信号产生时间点,制作标准曲线,定量目标物含量。该芯片成功应用于猪伪狂犬病毒的快速检测,一次进样仅0.4μL,可在1小时内高特异检出10fg的目标物量,定量线性曲线的R2值达到0.9894。 2)多重定性/定量LAMP微芯片具有多个发散式扩增池,通过连接管道与扩散限制毛细通道相连,中间为加样孔,利用微小结构通道中流体的低传质系数特性,杜绝了不同扩增池中信号的混串,实现了信号多重判定,通过整合反射式微型光纤,准确定量样品中目标核酸量。该芯片成功应用于季节性流感病毒、猪源性流感病毒和普通甲型流感病毒的一步快速分型,进样仅4μL,可在45min至60min内高特异区分出被检样品中流感病毒的类型,检测灵敏度可达10个拷贝以下,定量线性曲线的相关系数R2值达到分别为0.9897、0.9962和0.9984。 3)单重/多重集成LAMP微芯片由DNA提取室、LAMP扩增室和螺丝微阀组成,利用PDMS材料的弹性特质和螺丝微阀驱动和控制流体,成功地整合了核酸提取、扩增和信号检测,实现了sample-to-answer的诊断效果。该芯片成功应用于肺结核杆菌等细菌的快速诊断,仅需约10μL原始样品量,可以在45min至60min内通过肉眼快速判定样品中是否含有肺结核杆菌或分型多种细菌性病原体。以上三种模式LAMP微芯片操作简便、价格低廉、样品用量少、分析速度快且不依赖昂贵仪器,非常适合于床边分子快速检测和分析。该芯片体系可以扩展到其它任意病原体的床边快速检测,对于某些重大急性传染性病原体的基层防控具有十分重要的意义。


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