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丝素蛋白支架在尿道狭窄重建中的实验研究

郑捷  
【摘要】:目的:探索新西兰大白兔尿道狭窄模型建立的方法。 方法:将12只雄性新西兰大白兔随机分成两组,每组6只,平均体重2.84±0.15kg。A组为正常对照组。B组为尿道狭窄组:在戊巴比妥钠溶液静脉注射麻醉后,剥除1.0cm左右尿道粘膜,逐层缝合后留置F-8橡皮导尿管并固定。所有操作均在10倍光镜下,运用显微器械完成。术后观察两组实验兔,在饲养2个月时分别行顺行膀胱尿道造影、尿道测压和组织细胞学检测。术中和术后一周腹腔注射抗生素以预防感染。 结果:B组1只新西兰大白兔在麻醉后腹腔注射抗生素时出现休克表现,抢救无效死亡。在补充一只尿道狭窄组大白兔后,两组实验兔均顺利完成实验。术后1周左右,留置导尿管自行脱落。观察发现B组术后两个月后明显较第一组焦躁。 (1)膀胱尿道造影:术后两个月顺行膀胱尿道造影尿道狭窄组较对照组有明显狭窄,尿道管腔变细,粘膜粗糙不连续。 (2)尿道测压:A组(正常对照组)手术部位尿道压为14.67±2.16cmH20,B组(尿道狭窄组)手术部位尿道压为27.83±3.71cmH20,两者比较有明显差异(p0.01)。 (3)组织细胞学:HE染色提示,A组尿道上皮细胞均匀覆盖,层数3-4层,排列规则,未见炎性细胞;B组尿道有少量上皮细胞不均匀覆盖,个别地方没有上皮细胞,中间有中性粒细胞及淋巴细胞分布。 结论:运用显微外科技术进行局部尿道粘膜剥除术可以成功制造出新西兰大白兔尿道狭窄模型,并且具有很好的稳定性、可重复性以及狭窄段长度的可控性。膀胱尿道造影、尿道测压和组织细胞学是鉴定尿道狭窄比较可靠的方法。 目的:研究兔尿道上皮细胞体外的培养扩增情况以及在多孔丝素蛋白支架上的生长情况,探索适合尿道上皮细胞生长的支架孔径和实验环境。 方法:(1)新西兰大白兔尿道上皮细胞的培养和鉴定。提取新西兰大白兔尿道粘膜,通过漂洗、消化、静置、过滤、离心、悬浮、培养等步骤进行尿道上皮细胞的原代培养,经传代后用相差显微镜和免疫组化角蛋白抗体进行尿道上皮细胞的鉴定;(2)按照不同孔径分成三组:A组,多孔丝素蛋白支架孔径为20u m;B组,孔径为40μm;C组,孔径为80μm;(3)在相同实验环境下,将尿道上皮细胞接种到三组多孔丝素蛋白支架上,3天后用扫描电镜和光谱分析仪检测细胞代谢产物来观察各组细胞的生长情况。 结果:(1)顺利提取新西兰大白兔的尿道粘膜,并完成体外原代和传代培养,用相差显微镜和免疫组化角蛋白抗体的方法鉴定所培养的细胞为尿道上皮细胞;(2)将传代的尿道上皮细胞植入3组多孔丝素蛋白支架培养后,光谱分析仪在检测细胞代谢产物发现A组(孔径为20μm)的细胞代谢最旺盛,而且扫描电镜也发现A组的多孔丝素蛋白支架上有尿道上皮细胞生长。 结论:取材于新西兰大白兔尿道粘膜的尿道上皮细胞可在体外培养扩增,并且在孔径为20μm的片状多孔丝素蛋白支架上能够生长。 目的:初步探索片状多孔丝素蛋白支架在动物体内的降解情况。 方法:(1)将孔径为20μm的片状多孔丝素蛋白支架修剪成10*10*21mm(长*宽*高)方形小块共18枚,6枚一组植入新西兰大白兔背部皮下;(2)术后第2、4、8周,切开每只实验兔的2个切口,取出丝素蛋白小块。测量丝素蛋白小块的大小,观察丝素蛋白与宿主的反应。 结果:(1)体积上-——第2周,6片丝素蛋白小块基本都呈原来的形状,平均体积约为156±9.30mm3(较基线周体积缩小了17.89%),与基线周相比,有明显差异(p=0.014);第4周,6片丝素蛋白小块均失去原来形状,呈不规则形,平均体积约为38.33±14.56mm3(较基线周体积缩小了80.00%),与基线周相比,有明显差异(p0.001);第8周,6片丝素蛋白小块呈不规则形,平均体积约为7.00±2.00mm3(较基线周体积缩小了96.32%),与基线周相比,有明显差异(p0.001)。;(2)形态上——第2周,6片丝素蛋白小块基本都呈原来的形状,并且与周围组织无明显粘连,容易分离;第4周,6片丝素蛋白小块均失去原来形状,呈不规则形,与周围组织有粘连溶解,易分离;第8周,6片丝素蛋白小块呈不规则形,明显变小但未完全降解,与周围组织粘连溶解不易分离。 结论:20μm孔径的丝素蛋白在实验兔体内8周时,体积缩小约96.32%,但同时伴局部的粘连和溶解。 目的:初步探索用片状多孔丝素蛋白支架修补长段尿道狭窄和缺损。 方法:(1)将24只新西兰雄性大白兔随机分成4组:A组为正常对照组;B组为尿道狭窄组——剥除实验兔的尿道粘膜,不做修补,让其自行愈合;C组为多孔丝素蛋白支架组——剥除实验兔的尿道粘膜后,用多孔丝素蛋白支架进行修补;D组为尿道上皮细胞/多孔丝素蛋白支架复合物组——剥除实验兔的尿道粘膜后,用尿道上皮细胞-多孔丝素蛋白支架复合物进行修补。每组各6只,平均体重(2.87±0.16)kg;(2)4组共同饲养2个月后,分别进行膀胱尿道造影、尿动力检测(尿道测压)和组织细胞学检测,以观察片状多孔丝素蛋白支架以及尿道上皮细胞-多孔丝素蛋白支架复合物在修补长段尿道狭窄和缺损中的作用。 结果:A组6只实验兔完成2个月的实验。B组1只实验兔在行尿道剥离术时,腹腔注射头孢三嗪5分钟后出现休克表现死亡,补充1只实验兔后,6只实验兔完成2个月的实验。C组有1只实验兔在6周时出现死亡,其余5只完成实验。D组有1只实验兔在第4周时,多孔丝素蛋白支架复合物脱出,退出实验;另有1只实验兔在第5周时出现死亡,其余4只完成实验。 (1)尿道造影——术后2月,B组的造影片显示尿道粘膜连续性的改变,尿道管径变细,造影剂通过时不连贯,呈现尿道狭窄的表现,与A组相比有明显的尿道狭窄表现。C、D组膀胱尿道造影提示虽然尿道粘膜的连续性及管腔的直径都较A组有所加剧,但与B组相比,尿道粘膜的连续性及管腔的直径都有所好转。C组和D组之间,视觉上两组的尿道粘膜连续性及尿道管腔的大小无明显差异. (2)尿道测压——B、C、D组术后2月手术部位的尿道阻力明显增高,平均值分别为27.83±3.71cmH2O、18.00±1.87cmH2O、18.00±1.41cmH20,A组尿道阻力的平均值为14.67±2.16cmH20,后3组分别与A组相比均有明显的统计学差异(p0.05)。C组和D组分别与B组也有明显的统计学差异(p0.01)。但是,C组和D组的尿道阻力平均值之间无明显差异(p=1.00)。尿道测压图上,A照组则呈现平缓的低压波形;B组尿道手术部位呈现明显的密集高压波形;C、D组的手术区域的尿道阻力波形相似,均较B组低缓。 (3)组织细胞学——HE染色提示,A组尿道上皮细胞均匀覆盖,层数3-4层,排列规则,未见炎性细胞;B组尿道有少量上皮细胞不均匀覆盖,个别地方没有上皮细胞,中间有中性粒细胞及淋巴细胞分布;C组尿道上皮细胞均匀覆盖,层数4-5层,有炎性细胞;D组尿道上皮细胞均匀覆盖,层数4-5层,排列规则,偶见少量炎性细胞.。C组和D组与B组相比有明显的修复效果,而C组和D组之间无明显差异 结论:通过对4组实验兔的比较研究,我们可以初步得出:运用多孔丝素蛋白支架作为长段尿道缺损的修补替代材料,可以对尿道狭窄有明显的改善作用。但是尿道上皮细胞/多孔丝素蛋白支架复合物对长段尿道狭窄的改善程度没有明显优于单纯多孔丝素蛋白支架对长段尿道狭窄的修复。尿道修复段的炎症反应并不明显。


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