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胆道闭锁中LDOC1基因调控NF-κB介导炎症及凋亡反应的研究

宋再  
【摘要】:胆道闭锁(Biliary Atresia, BA)是引起3个月以内小儿阻塞性黄疸的主要原因,以肝内和肝外胆管进行性炎症、各级胆管梗阻和破坏为特征,从而导致胆汁淤积以及进行性肝纤维化和肝硬化。许多患儿往往在胆道闭锁确诊时已存在严重的肝纤维化,并且很快发展成为肝硬化,最终导致肝功能衰竭。即使成功进行了Kasia手术并重建胆汁流出道,仍然有68%~80%胆道闭锁患儿在手术后因为各级胆管进行性梗阻及炎症损伤,导致胆汁淤积和肝纤维化加重,进展为肝功能衰竭,最终需要接受肝脏移植。肝内胆道上皮细胞炎症损伤、凋亡和肝纤维化、肝硬化是胆道闭锁的主要病理改变,其发生和发展机制尚不明确。近年来,国内外研究发现NF-κ B介导的炎症和凋亡反应是重要的致病因素。基于基因芯片筛查结果,我们课题组前期发现,癌症亮氨酸拉链下调因子1(LDOC1)在胆道闭锁肝脏组织中高表达,生物信息学研究提示该基因对胆道闭锁的发病起核心调控作用。但其内在机制仍不十分清楚。因此本研究拟以LDOC1为切入点,深入探讨LDOC1与NF-κB介导的炎症及凋亡反应之间的内在关系及其在胆道闭锁发病中的作用,旨在阐明LDOC1在胆道闭锁发病和发展过程中的可能机制。 第一部分 猕猴轮状病毒(RRV)致胆道闭锁(BA) Balb/c小鼠模型的建立及LDOC1基因在模型中的表达 目的:应用RRV感染Balb/c新生小鼠建立胆道闭锁动物模型,并在模型中检测LDOC1表达及NF-κB介导的炎症和凋亡反应。 方法:感染组(n=31)新生小鼠出生后24小时内腹腔注射RRV (20μl106PFU);对照组(n=30)新生小鼠出相同时间腹腔注射20μl细胞培养液(EME)。生后5日内死亡或拒乳小鼠被排除出研究(RRV感染组中5只小鼠因拒乳或死亡被排除出研究,1只于第10日死亡,仅纳入生长发育研究,未纳入成模率研究。对照组中4只小鼠因拒乳或5日内死亡被排除出研究)。对比观察2组小鼠体重增长变化、无毛区黄染情况至第15天取材;取材后检测2组小鼠总胆红素(TBI)、直接胆红素(DBI)、谷丙转氨酶(AST)和谷草转氨酶(ALT)数值差异;HE染色分析小鼠肝内外病理变化;免疫组化(IHC)检测2组小鼠肝脏内LDOC1和NF-κB的表达差异;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清NF-κB下游炎症因子(IL-2、TNF-α)蛋白含量变化;利用末端脱氧核苷酸原位标记法(TUNEL法)检测肝脏组织中细胞凋亡率改变。对RRV感染小鼠组内出现完全肝外闭锁小鼠和未出现完全肝外闭锁小鼠上述指标同样进行对比。 结果: (1)对照组RRV感染组小鼠第5天平均体重较对照组降低(RRV感染组小鼠平均体重为3.3±0.7g,对照组平均为5.0±0.6g),但两者无统计学差异(p=0.0750.05)。从第7天至15天取材时,两组小鼠体重出现显著性差异,其中第儿天差异最大(RRV感染组平均体重5.11±0.8,对照组平均为13.46±1.3g,p=0.0170.05)。 (2)RRV感染组小鼠从第5天开始出现无毛区皮肤黄染,且TBI、DBI和AST、ALT水平与对照组相比显著升高(50.2±15.4umol/L vs14.5±3.8umol, p=0.0020.01;45.9±15.6umol/L vs12.5umol/L,p=0.0050.01;102±13U/L vs41±8U/L,p=0.0050.01;99±16U/L vs38±8U/L, p=0.0020.01);HE检查发现RRV感染组中68.8%小鼠出现完全性的肝外胆道闭锁,所有小鼠肝脏内均出现不同程度的炎症反应和肝内小胆管增生。 (3)免疫组化分析发现,RRV感染组小鼠肝脏内LDOC1和NF-κB抗体阳性表达率(64.0%、76.0%),与对照组(26.9%、34.6%)相比显著升高(p=0.0080.01;p=0.0030.01)。ELISA法检测RRV感染组小鼠血清IL-2和TNF-α蛋白光密度均值较对照组明显升高(1.52±0.21vs1.39±0.54,p=0.0410.05;1.63±0.41vs0.79±0.09,p=0.0020.01);RRV感染组小鼠肝脏组织凋亡细胞比率与对照组相比显著降低(29.9±4.6%vs39.9±5.8%,p=0.020.05);相关研究分析发现感染组内LDOC1和NF-κB抗体阳性表达存在相关性(p=0.0040.01) (4)RRV感染组小鼠中,出现肝外胆道闭锁的小鼠平均体重增长较未闭锁小鼠缓慢,第13天和15天平均体重存在显著性差异(5.6±0.3vs7.7±0.4,p=0.0440.05;7.3±0.9vs8.6±1.2,p=0.0480.05);闭锁小鼠TBI、DBI较未闭锁小鼠显著升高(54.2±13.3umol/L vs39.7±4.4umol, p=0.0220.01;49.9±15.6umol/L vs30.5±6.7umol/L, p=0.005(0.01):但AST、ALT无明显统计学差异(103±13U/L vs97±14U/L,p=0.0590.05;106±16U/L vs98±11U/L,p=0.890.05)。 (5)肝外胆道闭锁小鼠肝组织LDOC1和NF-κ B抗体阳性表达率与未闭锁小鼠相比显著升高(75.0%vs33.3%,p=0.0010.01;81.2%vs33.3%,p=0.0010.01)。血清ELISA检测结果发现肝外胆道闭锁小鼠IL-2和TNF-α蛋白光密度均值高于未闭锁小鼠(1.66±0.21vs1.41±0.33,p=0.0470.05;1.71±0.41vs1.39±0.28,p=0.0380.05);两者细胞凋亡率无统计性差异(40.3±5.9%vs37.8±4.8%,p=0.0680.05)。 结论: (1) RRV感染新生小鼠可成功制备出与人类胆道闭锁临床和病理相似的动物模型。 (2) NF-κB介导的炎症、凋亡反应在RRV感染致胆道闭锁动物模型中起重要作用。 (3) LDOC1在该动物模型中的高表达,并与NF-κB表达的相关性提示LDOC1可能通过调控NF-κB介导的炎症和凋亡反应对胆道闭锁的发生产生影响,提示其参与胆道闭锁形成的可能性。 第二部分LDOC1基因沉默在RRV致胆道闭锁小鼠模型中的作用研究 目的:腺病毒介导的RNA干扰(RNAi)方法沉默RRV感染致胆道闭锁小鼠肝脏组织内LDOC1基因的表达,研究LDOC1对NF-κB介导的炎症及凋亡反应是否具有调节作用,探索该基因沉默对模型小鼠的潜在治疗作用。 方法:构建LDOC1基因沉默的重组复制缺陷型腺病毒,对胆道闭锁动物模型进行干预。免疫荧光及Western-blot法明确肝脏组织中LDOC1基因的沉默情况。动物分3组:正常对照组(对照组n=26);RRV+RNAi无效干扰组(MOCK组,n=28);LDOCl+RNAi组(LDOCl干扰组,n=29)。生后5日内死亡或拒乳小鼠被排除出研究。基因沉默后,观察各组小鼠生长发育和肝功能变化;免疫组化、RT-PCR及Western-blot检测NF-κB和TGF-β表达改变;ELISA检测血清炎症因子IL-2和TNF-α含量改变。并检测LDOC1基因沉默后肝组织内凋亡变化。 结果: (1)免疫荧光显示LDOC1腺病毒干扰载体广泛分布于肝实质中,Western-blot检测发现,腺病毒载体转染后肝脏在内LDOC1蛋白表达显著下降(对照组,MOCK组、LDOC1干扰组中LDOC1蛋白相对表达量均值分别为0.83±0.02、0.74±0.03,0.23±0.02;LDOC1干扰组vs MOCK组,p=0.0050.01;LDOC1干扰组vs对照组,p=0.0030.01)。 (2) LDOC1干扰组小鼠各时间点平均体重均低于对照组;从第7天开始至第15天取材,2组小鼠平均体出现显著性差异(第7天:6.12±0.29g vs8.21±1.01,p=0.0380.05;第15天:11.30±1.20vs15.90±1.23,p=0.0120.05);LDOC1干扰组从第9天开始平均体重(7.12±0.59)显著高于MOCK组平均体重(4.59±1.02,p=0.0290.05),趋势持续至取材。 (3) LDOC1干扰组小鼠血清总胆红素(39.9±9.9umol/L)和直接胆红素(35.7±7.8umol/L)均显著高于对照组(13.1±2.1umol/L,p=0.004;7.2±2.1umol/L,p=0.003);但低于MOCK组(88.1±11.2umol/L,P=0.001,76.0±12.3umol/L,p=0.001);AST和ALT的检测结果显示出相同趋势。 (4)免疫组化检测发现LDOC1干扰组小鼠肝组织NF-κB抗体的阳性表达率明显低于MOCK组(54.1%vs76.0%,p=0.0230.05),而与对照组相比无明显差异(54.1%vs34.6%,p=0.7210.05)。RT-PCR检测发现,NF-κB mRNA在3组动物肝组中的相对表达量均值依次为:0.22±0.02、1.12±0.03、0.32±0.03,LDOC1干扰组显著低于MOCK组(p=0.0020.05),但与对照组无统计学差异(p=0.610.05)。Western-blot检测发现,3组动物蛋白相对表达量也显示出相同的趋势:对照组,MOCK组、LDOC1干扰组中LDOC1蛋白相对表达量均值分别是0.68±0.02、1.23±0.03、0.71±0.02;LDOC1干扰组显著低于MOCK组(p=0.0210.01),但与对照组无统计学差异(p=0.7630.05)。 (5) LDOC1基因沉默后免疫组化检测发现,TGF-β抗体在对照组、MOCK组和LDOC1干扰组小鼠肝脏组织中的阳性表达率依次为:42.3%,88.0%和45.8%;LDOC1干扰组TGF-β阳性表达率低于MOCK组(p=0.0310.05),与对照组无明显差异(p=0.6430.05)。LDOC1干扰组TGF-β mRNA的相对表达量均值(0.49±0.03)低于MOCK组(1.07±0.03,p=0.0050.01),LDOC1干扰组与对照组结果无统计学差异(0.52±0.03,p=0.7510.05)。对照组,MOCK组、LDOC1干扰组中TGF-β蛋白相对表达量的均值分别是0.29±0.01、0.88±0.03、0.21±0.02;LDOC1干扰组显著低于MOCK(p=0.0010.01),与对照组无统计学差异(p=0.5490.05)。 (6)凋亡检测发现,LDOC1干扰组小鼠肝脏内细胞凋亡率均值为48.1±4.9%,显著高于MOCK组(37.7±5.1%,p=0.0420.05),也高于对照组(25.2±3.6%,p=0.0080.01)。 (7) ELISA法检测LDOC1干扰组小鼠血清IL-2、TNF-α蛋白光密度均值为分别为1.08±0.04和0.87±0.41,与MOCK组相比显著下降(1.58±0.14,p=O。0360.05;1.49±0.11,p=0.0150.05)。与对照组相比无显著性差异(1.12±0.02,p=0.6280.05;0.79±0.01,p=0.710.05)。 结论: (1)腺病毒介导的LDOC1-RNAi载体可有效抑制RRV致胆道闭锁动物模型肝脏组织内LDOC1基因表达。 (2) LDOC1基因沉默可减轻胆道闭锁模型小鼠的胆汁淤积程度和肝脏损害。 (3) LDOC1基因沉默显著抑制胆道闭锁模型小鼠NF-κB表达,下游炎症因子IL-2和TNF-a含量也显著减少,细胞凋亡率升高。 (4) LDOC1基因沉默下调了RRV感染致胆道闭锁动物模型肝脏组织中TGF-β的表达,对小鼠纤维化形成具有一定调节作用。 第三部分LDOC1基因转染人胆道上皮细胞(HIBEC)的研究 目的:通过构建LDOC1基因慢病毒表达载体,将LDOC1转染入人胆道上皮细胞系(HIBEC),观察转染后胆道上皮细胞的NF-κB及其下游炎症因子的表达改变、胆道上皮细胞凋亡率和TGF-β的表达改变。在体外细胞水平探讨LDOC1在胆道闭锁发病过程中的可能机制。 方法:细胞分为3组:正常对照组(对照组),空载体转染组(MOCK组)和LDOC1基因转染组(LDOC1转染组)。使用免疫荧光、Western-blot及RT-PCR等方法检测LDOC1基因转染效率及转染后各组细胞NF-κB、TGF-β的表达差异,Hochest/PI法检测各组细胞间凋亡率差异。ELISA法检测组织液上清IL-2、TNF-α含量变化。 结果: (1)HIBEC在光镜下呈梭形或偏平梭形。转染后免疫荧光检测可见大部分胆道上皮细胞胞浆内均出现GFP绿色荧光蛋白表达;流式细胞检测结果显示转染效率为99.8%。 (2)慢病毒载体转染后,免疫荧光显示LDOC1转染组LDOC1抗体荧光表达率高达90%以上;对照组、MOCK组、LDOC1转染组细胞中LDOC1mRNA的相对表达量依次为:0.29,0.27,1.98;3组细胞LDOC1蛋白相对表达量分别为:0.31、0.27、0.99。表达水平高低趋势与mRNA水平一致,LDOC1转染组表达最高。 (3)转染后LDOC1转染组NF-kBp65阳性表达率超过80%,高于MOCK组和对照组(40%和30%);对照组、MOCK组、LDOC1转染组细胞中核p65蛋白相对表达量依次为:0.52、0.49、1.02。 (4)免疫荧光检测显示,3组细胞TGF-β抗体荧光阳性表达率均为50%左右。且RT-PCR和Western-blot检测结果显示出相同的趋势(TGF-β mRNA的相对表达量依次为:0.98,0.99,0.89;蛋白相对表达量分别为:0.58、0.61、0.71)。 (5)对照组、MOCK组和LDOCl转染组细胞凋亡率分别为21.9±2.8%、22.3±3.1%、2.8±0.7%,LDOCl转染组凋亡率显著低于MOCK组(p=0.035,0.05)以及对照组(p=0.034,0.05)。 (6) LDOC1转染组培养液上清IL-2、TNF-α蛋白光密度均值分别为1.01±0.07和0.71±0.09,与MOCK组(0.56±0.02,p=0.0020.01;0.41±0.02,p=0.0010.01)和对照组(0.41±0.03,p=0.0060.01,0.39±0.01,p=0.0010.01)相比显著升高。 结论: (1) LDOC1基因慢病毒表达载体,可成功地将LDOC1转染入人胆道上皮细胞:LDOC1转染组LDOC1抗体荧光表达率、mRNA表达量和蛋白表达量明显升高。 (2) LDOC1基因表达上调可以促进胆道上皮细胞NF-κB p65入核,激活下游炎症因子IL-2和TNF-α表达,同时可抑制细胞凋亡,但在体外细胞系中LDOC1基因表达上调对TGF-β影响不大。 (3)体外细胞系研究结果进一步提示LDOC1可能通过调节NF-κB相关的炎症和反应凋亡而参与胆道闭锁的形成。


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