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中国牦牛瘤胃未培养微生物来源的纤维素降解酶的筛选、克隆和鉴定

包蕾  
【摘要】:纤维素是世界上储量最丰富的可再生资源,为发展可再生生物燃料的提供了无尽的原料,但纤维素的糖化却一直是其利用过程中的瓶颈。为了寻找新型、高效的纤维素酶,本研究对中国牦牛瘤胃微生物纤维素降解酶资源进行了探索。 瘤胃样本细菌菌群分析显示,66.8%的细菌分布于硬壁菌门(Firmicutes)和27.9%的细菌分布于拟杆菌门(Bacteroidetes)。该样本中约10%的细菌为已知菌,包括了典型的瘤胃纤维素降解菌Ruminococcus albus, Butyrivibrio fibrisolvens和Fibrobacter succinogenes。其余约90%的细菌是不可培养微生物,其中很大一部分落入Ruminococcaceae科,Lachnospiraceae科和Prevotellaceae科,且与已知的瘤胃纤维素降解菌聚类在一起,提示它们可能为新型的不可培养纤维素降解菌。对其中的真菌菌群分析显示真菌含量约只有细菌的1%,含有具有纤维素降解能力的真菌Orpinomyces sp.。所以该瘤胃样本不仅含有已知纤维素降解菌,还可能含有许多不可培养的纤维素降解菌,提示了从中克隆到纤维素酶的高可能性。 基于该瘤胃样本中大部分微生物是不可培养的,我们使用宏基因组技术构建了中国牦牛瘤胃微生物的宏基因组文库,并对其进行功能筛选,获得了内切葡聚糖酶阳性克隆5个、外切葡聚糖酶阳性克隆24个、葡萄糖苷酶阳性克隆50个木糖苷酶阳性克隆27个和木聚糖酶阳性克隆6个。随后克隆和鉴定了其中的三个酶RuBGX2、RuBGX3和Ruce15B。 RuBGX2和RuBGX3均既有p-葡萄糖苷酶活性,又有p-木糖苷酶活性,属于糖苷水解酶家族3,具有48.9%的氨基酸序列一致性。他们的最适反应pH约为5左右,最适反应温度约为40℃,且对于p构型的糖苷底物均具有一定的广谱性,同时它既能水解纤维寡糖类底物,又能水解多种人工芳香基衍生底物。RuBGX2可水解聚合度为2、3、4的纤维寡糖,RuBGX3仅能水解聚合度为2、3的纤维寡糖。RuBGX2对1%的纤维二糖的转化率高达98.3%,对1%纤维四糖的转化率高达80%。RuBGX2和RuBGX3的β-葡萄糖苷酶活性使得他们可以降低纤维素水解中间产物的抑制作用来促进纤维素的水解,而β-木糖苷酶活性使得他们可以通过与木聚糖酶的协同作用来来促进半纤维素的水解。同源建模和分子对接结果显示RuBGX2和RuBGX3的β-葡萄糖苷酶活性和p-本糖苷酶活性来自于同一个活性中心,说明这两种活性是由底物的广谱特异性引起的。 Rucel5B既有内切葡聚糖酶活性,又有外切葡聚糖酶活性,属于糖苷水解酶家族5。它的内切葡聚糖酶活性高达219.7U/mg,外切葡聚糖酶活性高达52.9U/mg。Ruce15B的最适温度约60℃,在55℃处理1h后不丧失酶活,说明它具有比较高的热稳定性。底物特异性分析结果显示Ruce15B能够水解β-1,4葡萄糖苷键,但是不能水解β-1,3葡萄糖苷键β-1,6葡萄糖苷键和β-1,4木糖苷键,同时Ruce15B既能水解无定型纤维素(CMC, barley glucan, lichenan, PASC),又能水解晶体纤维素(微晶纤维素和滤纸avicel, filter paper)。进一步对Ruce15B的水解产物进行了色谱分析,结果显示它能从MuC的非还原端切割下纤维二糖,能够水解纤维四糖,avicel, filter paper和PASC并释放纤维二糖,说明了他的外切作用模式。而对可溶性无定型纤维素(CMC, barley glucan, lichenan)时间梯度降解结果显示在反应的开始阶段,产物的聚合度明显降低,提示Ruce15B具有内切的作用模式。 综上,本研究分析了牦牛瘤胃样本中微生物的多样性,建立了宏基因组文库功能筛选纤维素酶的平台,克隆并鉴定了两个β-葡萄糖苷酶/木糖苷酶RuBGX2和RuBGX3,和内切/外切葡聚糖酶Ruce15B。RuBGX2和RuBGX3不仅显示了葡萄糖苷酶和木糖苷酶两种活性,还显示了对纤维寡糖的高转化率和与木聚糖酶的协同作用;Ruce15B则显示出纤维素内切和外切作用模式,以及高活性和热稳定性的特质。这些研究结果都说明了瘤胃是新型纤维素降解酶的很好来源,这些纤维素降解酶在纤维素类生物质糖化的过程中具有很广阔的应用潜力。


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