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酵母双杂交筛选stratifin在结肠癌干细胞中相互作用的蛋白质

宓林  
【摘要】:背景 我们在前期研究中通过比较亲代结肠癌SW1116细胞株和结肠癌干细胞株(SW1116csc)之间的差异表达蛋白,发现其中Stratifin具有显著差异。本次实验进一步研究Stratifin在人结肠癌干细胞中相互作用的蛋白。 材料方法 人结肠癌干细胞株(SW1116csc)是本课题组前期从SW1116细胞株中分离出并传代培养。我们应用CLONTECH酵母双杂交系统(MATCHMAKER GAL4Two-Hybrid System3),提取SW1116csc中的细胞总RNA后进行反转录合成cDNA,转化大肠杆菌DH10B并构建cDNA初级文库,与pGADT7进行重组形成AD质粒。将Stratifin基因利用经PCR引入的SfiI酶切位点定向克隆至pGBKT7,转化大肠杆菌Top10,构建BD质粒pGBKT7-SFN,并用卡那霉素筛选相应阳性克隆,通过酶切提取质粒鉴定插入片段的大小。将序列正确的文库质粒pGADT7-SW1116csc及诱饵质粒pGBKT7-SFN共同转化至酵母菌株AH109,检测诱饵质粒有无毒性作用及自激活功能。通过酵母双杂交系统筛选人结肠癌干细胞cDNA文库中与Strafitin相互作用的蛋白,筛选出His3+/LacZ+/Ade2+阳性转化子并进行DNA测序和BLAST比对。 实验结果 构建的pGADT7-SW1116csc文库质粒经PCR扩增,检测发现片段长度约1.5Kbp左右,pGBKT7-SFN经SfiI酶切后产生1.0Kbp以上大小的片段,均与理论扩增大小一致。将酵母双杂交系统中的重组诱饵载体pGBKT7-SFN与人结肠癌干细胞cDNA文库质粒DNA共同转化至酵母菌株AH109,报告基因的检测结果显示其不具有毒性及自激活效应。利用酵母双杂交的方法筛选出了7个与Stratifin蛋白相互作用的His3+/LacZ+/Ade2H+阳性转化子,通过DNA测序和BLAST比对得共到了4种相关蛋白:BAD、MPRIP、CHRM17、TMEM45B。 结论 成功构建了在酵母中表达正确的人结肠癌干细胞酵母双杂交文库质粒pGADT7-SW1116csc,并通过酵母双杂交技术筛选得出了人结肠癌干细胞中包括BAD、 MPRIP、CHRM17、TMEM45B在内共4种与Stratifin相互作用的蛋白。初步阐明了Stratifin对结肠癌干细胞增殖和分化的调控机制,为下一步的深入研究提供了依据。


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