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基于高效液相色谱及液质联用的化学药品有关物质研究

宋冬梅  
【摘要】:药物中的杂质指任何影响药物纯度的物质,包括有机杂质、无机杂质和残留溶剂。无机杂质和残留溶剂的研究及检测方法相对比较成熟,方法的通用性比较强,控制标准也比较明确,目前已得到了较好的研究与控制。与无机杂质及残留溶剂相比,有机杂质(即有关物质)的研究与控制要复杂得多,在杂质的分离鉴定、杂质来源分析、杂质限度确定等方面,都需要结合药物的结构特点、制备工艺、贮藏稳定性等进行大量的深入细致的研究工作。虽然关于有关物质研究的技术指导原则已于2005年颁布,但由于研究工作难度较大,有关物质的研究与控制一直是化学药品新药研究和技术评价中的重点和难点,是国内药品研究工作中的主要薄弱环节之一。因此,在国家药品标准提高的工作中,有关物质的研究工作也显得尤其重要。 在有关物质的研究中,高效液相色谱法(HPLC)由于其灵敏度高,定量重现性及耐用性好,尤其对同系列物及降解产物分离度好,而被广泛应用。而液质联用技术(LC-MS)在杂质的定性及微量杂质的定量研究工作中,也起了重要作用。本论文首先以HPLC为主要技术手段,对醋酸甲羟孕酮及片剂的有关物质进行了研究;接着对氨基己酸采用HPLC法分析有关物质,又辅以LC-MS技术,对氨基己酸的主要杂质进行了定性研究;最后采用了高效液相色谱法-四极/飞行时间质谱法联用技术(HPLC-QTOF MS),对马来酸依那普利及中间体中的杂质进行了定量分析,对肾上腺素原料药及盐酸肾上腺素注射液中的有关物质进行了定性分析。 1.醋酸甲羟孕酮有关物质的HPLC方法研究 建立了对醋酸甲羟孕酮有关物质的HPLC分析方法。醋酸甲羟孕酮及其片剂已被中国药典2010版二部收载。我们首先将中国药典2010版与欧洲药典7.0的有关物质高效液相测定方法进行了比较,后者在方法的专属性,准确性等方面较好,杂质A、B、C、D、E、G、I和H等8个已知杂质峰之间分离度良好。用该方法对醋酸甲羟孕酮片剂中的有关物质进行了测定,由测定结果可知,片剂中的主要杂质为杂质H、D,杂质H为原料带入的合成中间产物,杂质D为贮存过程中的降解产物。为了解决目前国内尚无含各杂质的醋酸甲羟孕酮系统适用性对照品的问题,我们又建立了简便的系统适用性试验方法,即采用醋酸甲地孕酮与醋酸甲羟孕酮的相对保留时间确定色谱系统的准确性,保证了在无系统适用性对照品时仍能获得正确的结果。 由于杂质F(4,5-二氢醋酸甲羟孕酮)在上述HPLC色谱系统中无法测定,我们建立了另一HPLC法测定醋酸甲羟孕酮中的杂质F,在优化的色谱条件下,杂质F在2~50μg/ml浓度范围内线性关系良好(r=0.9999),原药与片剂中的回收率均为99.2%,RSD分别为0.9%(n=6)与1.0%(n=4),检测限(LOD)为2.0μg/ml。我们测定了醋酸甲羟孕酮和杂质F的相对校正因子和相对保留时间,解决了中国药典没有杂质F对照品而无法定量的问题。 2.氨基己酸有关物质的HPLC与HPLC-QTOF MS方法研究 建立了氨基己酸注射液有关物质HPLC的测定方法。在优化的色谱条件下,氨基己酸在10.12-1012μg/ml浓度范围内,其峰面积与浓度呈良好线性关系(r=1.0000),LOD为2.5μg/ml。对检测到的两个主要杂质,经HPLC-QTOF MS分析,初步推测分别为己内酰胺与氨基己酸二聚体,并且其中一个杂质用已内酰胺对照品进行了确认。采用己内酰胺对照品进行HPLC定量检测,己内酰胺在0.1006~2.013μg/ml范围内,其峰面积与浓度呈良好线性关系(r=0.9999), LOD为0.04μg/ml,回收率为102.0%,RSD为1.0%(n=6)。对氨基己酸二聚体的响应因子进行了初步考察,氨基己酸二聚体对氨基己酸的相对校正因子为0.061。 3. HPLC-QTOF MS法定量分析马来酸依那普利及中间体中的对甲苯磺酸乙酯 采用HPLC-QTOF MS法测定马来酸依那普利及中间体中的对甲苯磺酸乙酯。甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯的临床前研究发现它们的DNA烷基化作用会导致诱变效应,致癌效应和致畸效应。因此其它低分子量磺酸(如对甲苯磺酸)的烷基酯可能也存在着类似的毒性影响,为基因毒性杂质。我们建立了HPLC-QTOFMS法测定马来酸依那普利及中间体N-[1-(S)-乙氧甲酰基-3-苯丙基]-L-丙氨酸中对甲苯磺酸乙酯。对甲苯磺酸乙酯在0.2005-5.0127μg/ml浓度范围内线性关系良好。日内和日间精密度良好,RSD小于6.7%(n=9)。定量限(LOQ)和LOD为0.2μg/ml、0.1μg/ml。对甲苯磺酸乙酯在马来酸依那普利及中间体中的回收率分别为102.61%和90.80%,RSD%为7.0%(n=9),7.2%(n=9)。 4.肾上腺素原料及盐酸肾上腺素注射液杂质的HPLC-QTOF MS定性分析 采用HPLC-QTOF MS对肾上腺素原料药及盐酸肾上腺素注射液杂质进行了定性分析。原料药和注射液中共检出3个杂质,分别为肾上腺酮、肾上腺素磺化物和4-[2-(丁基-2-基氨基)-1-羟乙基]苯酚。QTOF MS不仅能给出准确分子量信息,而且能把感兴趣的离子作为前体离子,加以一定的碰撞能量,获得产物离子的二级质谱,得到的结构信息再结合高分辨数据,能更合理的鉴定未知成分。 本文采用HPLC法及LC-MS技术,完善了醋酸甲羟孕酮与氨基己酸注射液在有关物质方面的研究,制定了醋酸甲羟孕酮与氨基己酸的有关物质测定方法,提高了药品的质量标准,保证了人民的用药安全。在研究工作中,采用液质联用技术对马来酸依那普利及中间体中的杂质进行定量分析,对肾上腺素原料药及盐酸肾上腺素注射液中的有关物质进行定性分析,为有关物质研究的深入开展打下了基础。


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