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从HIF-1α与氧化应激的相互关系探讨红景天抑制动脉粥样硬化形成的机制

徐茂椿  
【摘要】:第一部分红景天对低氧诱导氧化应激apoE-/-小鼠动脉硬化的保护作用目的:应用间歇性低氧结合高脂诱导apoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型,观察红景天对小鼠主动脉斑块形成的影响。初步探讨其机制,着重了解低氧与氧化应激在红景天抑制动脉粥样硬化形成中扮演的角色。方法:1、动物造模:8周龄雄性apoE-/-小鼠在高脂饮食的喂养条件下,置于低氧饲养箱内以每日12小时间歇性低氧(10%02)刺激12周,制作小鼠低氧诱导氧化应激致动脉粥样硬化模型。2、分组及给药方法:将小鼠随机分为低氧和正常氧两大组,两大组内再分为6个小组,每小组各6只,分别为(1)正常饮食组(normal diet组,ND);(2)高脂饮食组(high fat diet组,HFD);(3)高脂饮食+低剂量红景天组(low dose Rhodiola组,Rd-L,2.5g/kg. d);(4)高脂饮食+中剂量红景天组(Moderate dose Rhodiola组,Rd-M,5g/kg.d);(5)高脂饮食+高剂量红景天组(High dose Rhodiola组,Rd-H,10g/kg. d):(6)高脂饮食+阳性药物对照维生素E组(VitE组,VE,1g/kg.d)。各干预组小鼠每日上午给予不同剂量药物灌胃一次,对照组小鼠用等量蒸馏水灌胃,连续12周。3、标本收集和指标检测:实验第12周末,采集小鼠血清及主动脉标本检测如下指标:(1)ELISA检测血清氧化低密度脂蛋白(oxLDL);(2)油红0及HE染色观察主动脉斑块分布、大小及组织病理变化;(3)免疫组化检测主动脉内皮细胞及斑块内核转录因子κ B(NF-κ B)的表达;(4)DHE阴离子荧光探针检测主动脉原位活性氧(ROS)水平;(5)分光光度法检测主动脉组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)活性和脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量。(6)实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法检测小鼠主动脉中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF) mRNA表达及蛋白含量。 结果:1、一般情况和动物模型的大体观察实验过程中共死亡小鼠4只。实验结束时每组动物数目大于5只。12周后apoE-/-小鼠主动脉血管内壁可见黄色纵向走行脂质条纹和连接呈片状粥样斑块,集中在弓部和腹主动脉。低氧条件下,斑块面积及厚度加重。各组小鼠间体重无明显差异(P0.05)。2、血清LDL水平12周高脂饮食后apoE-/-小鼠血清LDL水平显著增高,与普通饮食组比较,有显著统计学差异(P0.01),而红景天不影响血清LDL水平,各干预组间比较(P0.05)。3、主动脉整体油红0染色低氧组斑块面积明显高于常氧组(低氧ND:11.10%±4.56%vs.常氧ND:2.1%±1.3%,P0.01;低氧HFD:35.33%±4.51%vs.常氧HFD:25%±3.61%,P0.01)。低氧条件下,维生素E及各剂量红景天组斑块面积,较高脂饮食组明显减小(P均0.05);其中以高剂量组最为显著,与维生素E组比较,有显著统计学差异(低氧Rd-H:4.34%±2.06%vs.低氧VE:12.03%±3.6%,P0.05)。而常氧各剂量红景天组斑块面积与高脂饮食组相比,无明显改变(P0.05)。4、DHE染色低氧组主动脉原位的DHE荧光强度较常氧组显著增加(低氧ND:45.1±5.78vs.常氧ND:8.0±1.15,P0.05;低氧HFD:73.2±4.16vs.常氧HFD:34.2±7.93,P0.05)。低氧各剂量红景天组DHE荧光强度较高脂饮食组均显著降低(P0.01);其中以高剂量红景天组降低最为显著(低氧Rd-H:8.16±3.05vs.低氧VE:23.67±6.17,P0.05)。而常氧各剂量红景天组DHE荧光强度与高脂饮食组比较,无明显统计学差异(P0.05)。5、氧化及抗氧化指标低氧组主动脉中MDA的含量较常氧组显著增加(低氧ND:3.53±0.54nmol/mg.pro vs.常氧ND:1.28±0.18nmol/mg.pro;低氧HFD:8.09±0.67nmol/mg.pro vs.常氧HFD:4.82±1.11nmol/mg.pro,P0.05)。低氧各剂量红景天组MDA含量均显著低于高脂饮食组,差异有统计学意义(P0.01)。而常氧各剂红景天组MDA的含量,与高脂饮食组相比,无明显统计学差异(P0.05)。低氧组主动脉中SOD的活性较常氧组显著降低(低氧ND:17.21±4.26Umg/mg.provs.常氧ND:31.43±0.77Umg/mg.pro:低氧HFD:7.01±1.12Umg/mg.pro vs.常氧HFD:13.92±2.97,P0.05)。低氧中、高剂量红景天组SOD活性显著增高,与高脂饮食组比较,差异有显著统计学意义(P0.01),其中高剂量组SOD的活性,与维生素E组比较,无统计学差异(P0.05)。6、血清oxLDL含量低氧高脂饮食后小鼠血清oxLDL含量明显增高(低氧HFD:20.98±2.61ng/ml vs.常氧HFD:11.27±1.56ng/ml,P0.05)。低氧低、中、高剂量红景天组oxLDL含量(分别为10.25±2.07、6.13±1.15、5.12±1.02ng/ml)均显著低于高脂饮食组P0.01;其中以高剂量红景天组降低最为显著(低氧Rd-H:5.12±1.02ng/ml vs.低氧VE:10.52±2.15,P0.05)。常氧各剂量红景天组oxLDL含量,与高脂饮食组比较,差异无统计学意义(P0.05)。7、免疫组化低氧普通饮食组小鼠主动脉组织切片中NF-κ B p65阳性细胞数明显高于常氧普通饮食组,光密度相对值存在显著性差异(低氧ND:39.67±3.93vs.常氧ND:20.33±2.91,P0.05)。低氧结合高脂饮食后核染色阳性数量增加更为显著(低氧HFD:70.1±10.39vs.低氧ND:39.67±3.93,P0.01)。常氧高剂量红景天组及低氧中、高剂量红景天组NF-κB p65表达降低,与对应高脂饮食组相比,光密度相对值有显著差异(P0.05);其中以低氧高剂量红景天组效果最为明显,斑块内仅有少量核表达阳性细胞,与常氧高剂量组比较,有统计学差异(低氧Rd-H:8.67±3.48vs.常氧Rd-H:39.67±5.45,P0.05)。8、实时荧光定量PCR两大组内各干预小组(包括高脂饮食和红景天干预组)HIF-1α及VEGF mRNA表达,与普通饮食对照组比较,均无统计学差异(P0.05).9、Western blot检测与普通饮食组比较,低氧或高脂饮食均能诱导小鼠主动脉内HIF-1α蛋白量增高(P0.05)。常氧各剂量红景天组和维生素E组小鼠主动脉内HIF-1α及VEGF蛋白量与普通饮食组比较,无统计学差异(P0.05)。低氧各剂量红景天组小鼠主动脉内HIF-1α及VEGF蛋白表达均较普通饮食组显著增高,并且与高脂饮食组比较,也有显著统计学差异(P0.01)。低氧维生素E组HIF-1α及VEGF蛋白量与普通饮食组比较,无统计学差异(P0.05)。 结论: 1、间歇性低氧诱导了apoE-/-小鼠体内氧化应激水平的增高,致使主动脉内ROS水平增加,脂质过氧化加剧,NF-κ B p65表达增强,导致了动脉粥样硬化斑块的形成。 2、间歇性低氧和高脂饮食均能促进apoE-/-小鼠主动脉HIF-1α蛋白含量增加。 3、在低氧的情况下,红景天能有效抑制主动脉内ROS过度生成,减轻脂质过氧化,降低斑块中NF-κB p65聚集,最终抑制动脉斑块形成。 4、在低氧情况下,红景天抗氧化应激和抑制斑块形成的作用要强于维生素E。并且与维生素E对HIF-1α蛋白表达的抑制作用相反,红景天在低氧条件下,显著增高了主动脉内HIF-1a及下游VEGF的蛋白含量。 第二部分从HIF-1a与ROS间的相互作用探讨红景天苷抑制氧化应激的机制目的:利用过氧化氢(H202)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)产生氧化应激的细胞模型,探讨ROS与HIF-1α之间的相互调节作用,并观察红景天苷(salidroside)对HIF-1α和ROS的调节作用及相互联系,以助于探讨红景天抑制氧化应激诱导的动脉粥样硬化的可能机制。方法:经外源性H2O2处理体外培养的HUVECs制作氧化应激细胞模型,予以红景天苷干预后,采用(1)WST-1法观察细胞活力的改变;(2) DCFH-DA法观察细胞内ROS水平的变化;(3) Realtime PCR检测细胞内HIF-1α mRNA表达变化;(4)Western blot检测HIF-1a蛋白含量和降解速度及PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响;(5)设计合成3条HIF-1α siRNA干扰序列,构建含低氧反应元件(HRE)启动子序列的报告基因质粒PGL3-HRE,构建pCDH-HIF-1α真核表达质粒;(6)利用报告基因质粒PGL3-HRE转染HUVECs,以双荧光素酶报告系统检测HIF-1α转录活性;(7)利用HIF-1α siRNA或pCDH-HIF-1α质粒转染HUVECs,在下调或上调细胞内HIF-1a的情况下,以DCFH-DA法检测细胞内ROS的变化。结果:(1)外源性H202对HUVECs具有浓度依赖性的损伤作用,浓度越大,细胞内ROS水平越高,细胞的存活率越低,而红景天苷呈现剂量依赖性的抑制H202所致的细胞损伤,降低内皮细胞内过多的ROS生成,改善细胞生存率。其中100μg/m1红景天苷使细胞存活率增加到79%±4.5%,与H202组比较,差异有显著性(p0.05)。(2)与对照组比较,H2O2使HUVECs内HIF-1α mRNA和蛋白水平均显著增高(P0.05)。(3)无论在常氧或氧化应激条件下,红景天苷对细胞内HIF-1α mRNA均无显著影响(P0.05)。(4)常氧条件下,红景天苷对细胞内HIF-1α蛋白含量无显著影响。而在氧化应激条件下,红景天苷促使细胞内HIF-1α蛋白表达显著增高,并且与H202组比较,存在显著性统计学差异(P0.05)。(5)加入放线菌酮(CHX)处理细胞,以观察相对HIF-1α蛋白降解情况。单独应用CHX处理的HUVECs15分钟时HIF-1α蛋白表达基本消失。而红景天苷干预后30分钟时细胞内仍有HIF-1α蛋白表达。(6)双荧光素酶报告检测结果表明,与转染pGL3空载体组或转染PGL3-HRE质粒组相比,H202干预后,荧光素酶活性显著增强(p0.01)。而在H2O2造成的细胞内氧化应激增高的条件下,与pGL3-HRE+H2O2组比较,红景天苷使荧光素酶活性更升高了4.5倍(p0.01)。(7)红景天苷可促进PI3K/AKT/mTOR信号通路中相关蛋白及HIF-1α表达,采用PI3K抑制剂LY294002处理细胞,可见PI3K/AKT/mTOR信号转导通路介导的HIF-1α表达下调。(8)经Western blot鉴定,3条siRNA序列均有沉默HIF-1α的作用,其中HF1序列的沉默作用最强(p0.05)。pCDH-HIF-1α真核表达质粒转染HUVECs后,HIF-1α表达显著上调。(9)siRNA抑制内源性HIF-1α表达后细胞抗氧化能力显著降低,红景天苷抑制H202诱导的氧化应激能力减弱,与随机引物序列阴性对照+H202组比较P0.05。(10)与转染空载体pCDH的细胞组相比,转染pCDH-HIF-1α真核表达质粒上调HIF-1α后,抑制了H202诱导的ROS生成(p0.01),加用红景天苷后ROS水平进一步降低,但与H2O2+pCDH-HIF-1α组比较,无显著统计学差异(P0.05)。 结论: 1、常氧条件下,ROS对HUVECs内HIF-1α表达有正向促进作用,并使其转录活性增强。HIF-1α对ROS具有反馈作用,能抑制细胞内的ROS过度生成。 2、红景天苷抑制H202所诱导的HUVECs氧化应激损伤,降低细胞内ROS过度生成,并促进HUVECs增殖。 3、红景天苷对HUVECs内HIF-1a基因转录水平没有显著影响,但在氧化应激的条件下,能提高HIF-1α蛋白稳定性、增强其转录活性。红景天苷对HIF-1α的上调作用有赖于PI3K/AKT/mTOR信号通路。在氧化应激的状态下,红景天苷的抗氧化作用依赖于HIF-1α的激活。


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