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胃癌PI3K/AKt/mTOR信号传导通路的协同与耐药机制

季冬梅  
【摘要】:第一部分依维莫司联合MK2206对PTEN缺失胃癌细胞的协同作用 背景:晚期胃癌患者治疗效果较差,中位生存期仅一年左右,急需新的方法来改善这类患者预后,而分子靶向治疗是近年来发展最快的治疗策略。哺乳动物雷帕霉素靶点(mammalian target of rapamycin, mTOR)抑制剂依维莫司(Everolimus, RAD001)是靶向mTORC1的化合物,临床前研究提示依维莫司可以负反馈地引起上游丝氨酸苏氨酸蛋白酶Akt的激活,从而影响抗肿瘤效果。本研究将观察加入Akt抑制剂剂MK2206后是否能够产生协同作用,增强抗肿瘤效果,并进一步阐明两药协同的机制。 方法:我们首先从6株人胃癌细胞株中筛选出一株对依维莫司敏感的细胞株作为研究对象,检测依维莫司和MK2206单药或两药联合后对细胞增殖抑制、细胞周期阻滞、细胞凋亡、细胞自噬的影响以及对mTOR通路上游及下游相关蛋白、ERK/MAPK通路相关蛋白、细胞周期蛋白、自噬相关蛋白表达水平的影响。 结果:我们的研究显示,依维莫司和MK2206能够协同地作用于PTEN (phosphatase and tensin homolog)突变的胃癌HGC-27细胞株,在细胞周期阻滞、细胞增殖抑制和诱导细胞死亡上均具有协同作用。依维莫司和MK2206所导致的细胞死亡并非由于细胞凋亡,两药作用于HGC-27细胞后可协同引起自噬微管相关蛋白轻链3B(LC3B)抗体和自噬相关基因beclin-1的表达,提示这种细胞死亡可能是自噬性细胞死亡。在依维莫司联合MK2206处理细胞的同时加入自噬抑制剂3甲基腺嘌呤和氯喹,死亡细胞减少,这进一步提示细胞自噬性死亡,而非凋亡性死亡在依维莫司和MK2206共同作用导致的细胞死亡中占主要作用。在机制研究中,我们发现依维莫司与MK2206的联合强化了对Akt/mTOR通路的抑制、对细胞周期蛋白Dl (cyclin Dl)下调,并发现了细胞ERK/MAPK通路的激活。用MEK/ERK抑制剂PD98059和U0126可以抑制依维莫司联合MK20206引起的beclin-1的表达、自噬作用以及HGC-27细胞的死亡;用beclin-1siRNA可以抑制细胞自噬,但对MAPK的表达没有影响。 结论:PETN缺失的胃癌细胞对依维莫司较为敏感:依维莫司联合MK2206能够对HGC-27细胞产生协同抗肿瘤作用,其机制中包含了ERK依赖的细胞自噬性死亡通路。 第二部分导致依维莫司耐药的关键信号通路 背景:以往的临床研究证明,依维莫司在胃癌中的疗效还不够理想,治疗有效的胃癌患者很容易产生对依维莫司的继发性耐药。由于mTOR处于PI3K/Akt/mTOR信号传导通路的中心位置,与细胞内许多其他信号通路均有联系,因此在胞内寻找其关键耐药机制难度较大,本研究将首先从位于胞膜的酪氨酸激酶受体入手,初步探索引起敏感胃癌细胞株HGC-27对依维莫司耐药的关键信号通路。 方法:我们首先通过加药诱导培养出稳定的耐依维莫司(RAD001)的HGC-27细胞(HGC-27-resistant to RAD001, HGC-27-RR),然后用高通量蛋白芯片筛选出这两株遗传学背景相同的细胞的差异表达蛋白,之后挑选出部分差异表达的位于胞膜的酪氨酸激酶受体,验证这些差异蛋白是否介导了HGC-27细胞对依维莫司的耐药。 结果:高通量蛋白芯片筛选的结果显示,与HGC-27细胞相比,HGC-27-RR细胞中EGFR, PDGFR, FGFR, VEGFR的某些位点的磷酸化增多。进一步研究发现,HGC-27-RR磷酸化FGFR1的表达较HGC-27明显高,并且用FGFR1的抑制剂TSU68可以明显抑制HGC-27-RR细胞的生长。这提示FGFR1通路可能在HGC-27细胞对依维莫司耐药的过程中起了重要的作用。在功能验证中,我们发现用bFGF刺激HGC-27细胞后可以引起该细胞对依维莫司的耐药,并且FGFR抑制剂AZD4547可以逆转由bFGF介导的HGC-27对依维莫司的耐药。 结论:FGFR通路激活在HGC-27细胞对依维莫司产生继发耐药的过程中起了重要作用,但其具体机制仍需要我们进一步探索。


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