收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

脐带间充质干细胞修复鼻黏膜放射性损伤的效果和机制研究

段洪刚  
【摘要】:第一部分人脐带间充质干细胞的分离、培养、鉴定及荧光标记目的:探讨分离,培养,鉴定,荧光标记人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的方法,研究其生物学特性,为后期动物实验及体外实验做准备。方法:分别用酶消化法和组织块法分离培养hUC-MSCs,用含10%FBS的DMEM/F12培养基,在37℃、5%CO2条件下进行培养,每3-4 d按照1:3比例传代。倒置显微镜观察细胞形态,统计开始收获原代(P0)细胞的时间和PO细胞的产量,CCK8法检测细胞增殖能力,台盼蓝染色检测冻存复苏活细胞比例。通过观察细胞贴壁能力,流式细胞术检测细胞表型,体外成脂、成骨、成软骨定向诱导检测分化能力,鉴定其是否符合间充质干细胞国际标准。用携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体(Ad-GFP)转染hUC-MSCs标记细胞,流式细胞术检测标记效率。结果:hUC-MSCs呈长梭形,贴壁生长,细胞密集时呈放射状或漩涡状排列。酶消化法细胞收获PO细胞时间早于组织块法(7.75±2.50 d VS 11.00±0.82 d),但产量低于后者(1±0.24×105/cm VS 1±0.42×106/cm)。两种方法获得细胞增殖能力,冻存复苏活细胞比例无明显差异。两种方法获得细胞都能在塑料培养容器上贴壁,流式检测阳性表达率依次是CD45 (0.437%), CD90 (96.7%), CD105 (34.9%), CD146 (92.4%),在体外诱导环境下能向脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞分化。Ad-GFP转染hUC-MSCs后可见较强绿色荧光,流式检测GFP阳性率94.4%。结论:酶消化法和组织块法均可获得足量原代hUC-MSCs,通过细胞形态,表型,成骨,成脂,成软骨分化鉴定证明符合国际干细胞协会标准。Ad-GFP转染hUC-MSCs具有效率高,荧光强的特点。第一部分人脐带间充质干细胞的分离、培养、鉴定及荧光标记目的:探讨分离,培养,鉴定,荧光标记人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的方法,研究其生物学特性,为后期动物实验及体外实验做准备。方法:分别用酶消化法和组织块法分离培养hUC-MSCs,用含10%FBS的DMEM/F12培养基,在37℃、5%CO2条件下进行培养,每3-4 d按照1:3比例传代。倒置显微镜观察细胞形态,统计开始收获原代(P0)细胞的时间和PO细胞的产量,CCK8法检测细胞增殖能力,台盼蓝染色检测冻存复苏活细胞比例。通过观察细胞贴壁能力,流式细胞术检测细胞表型,体外成脂、成骨、成软骨定向诱导检测分化能力,鉴定其是否符合间充质干细胞国际标准。用携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体(Ad-GFP)转染hUC-MSCs标记细胞,流式细胞术检测标记效率。结果:hUC-MSCs呈长梭形,贴壁生长,细胞密集时呈放射状或漩涡状排列。酶消化法细胞收获PO细胞时间早于组织块法(7.75±2.50 d VS 11.00±0.82 d),但产量低于后者(1±0.24×105/cm VS 1±0.42×106/cm)。两种方法获得细胞增殖能力,冻存复苏活细胞比例无明显差异。两种方法获得细胞都能在塑料培养容器上贴壁,流式检测阳性表达率依次是CD45 (0.437%), CD90 (96.7%), CD105 (34.9%), CD146 (92.4%),在体外诱导环境下能向脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞分化。Ad-GFP转染hUC-MSCs后可见较强绿色荧光,流式检测GFP阳性率94.4%。结论:酶消化法和组织块法均可获得足量原代hUC-MSCs,通过细胞形态,表型,成骨,成脂,成软骨分化鉴定证明符合国际干细胞协会标准。Ad-GFP转染hUC-MSCs具有效率高,荧光强的特点。第二部分hUC-MSCs修复豚鼠鼻黏膜放射性损伤的效果目的:检测hUC-MSCs静脉注射和条件培养液滴鼻对豚鼠鼻黏膜放射性损伤模型的治疗效果。方法:构建豚鼠鼻黏膜放射性损伤模型,静脉注射hUC-MSCs或鼻腔滴注hUC-MSCs浓缩条件培养液干预,正常豚鼠和放疗但不干预豚鼠作为对照,在放疗结束后1周,1月,3月,6月分别用炭末法检测豚鼠鼻黏膜粘液纤毛清除时间(MCT),鼻黏膜切片HE染色观察病理改变,扫描电镜观察黏膜纤毛覆盖率及纤毛形态评估治疗效果。结果:hUC-MSCs静脉注射和条件培养液滴鼻组在放疗结束后1周,1月时,粘液纤毛清除时间,黏膜水肿程度均优于放疗对照组。放疗后第6月条件培养液滴鼻组纤毛覆盖率及纤毛形态优于放疗对照组。结论:hUC-MSCs静脉注射和条件培养液滴鼻对豚鼠鼻黏膜放射性损伤模型有治疗作用。方法:构建豚鼠鼻黏膜放射性损伤模型,静脉注射hUC-MSCs或鼻腔滴注hUC-MSCs浓缩条件培养液干预,正常豚鼠和放疗但不干预豚鼠作为对照,在放疗结束后1周,1月,3月,6月分别用炭末法检测豚鼠鼻黏膜粘液纤毛清除时间(MCT),鼻黏膜切片HE染色观察病理改变,扫描电镜观察黏膜纤毛覆盖率及纤毛形态评估治疗效果。结果:hUC-MSCs静脉注射和条件培养液滴鼻组在放疗结束后1周,1月时,粘液纤毛清除时间,黏膜水肿程度均优于放疗对照组。放疗后第6月条件培养液滴鼻组纤毛覆盖率及纤毛形态优于放疗对照组。结论:hUC-MSCs静脉注射和条件培养液滴鼻对豚鼠鼻黏膜放射性损伤模型有治疗作用。第三部分hUC-MSCs修复鼻黏膜放射性损伤的机制研究目的:探讨hUC-MSCs修复鼻黏膜放射性损伤的机制。方法:携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体(Ad-GFP)标记hUC-MSCs,经静脉注射到豚鼠模型,注射后第3天,10天,20天,30天取鼻黏膜冰冻切片,采用荧光显微镜下直接观察和免疫荧光染色方法检测GFP标记细胞迁徙、分化情况。体外培养并鉴定人鼻黏膜上皮细胞,与hUC-MSCs共培养,观察hUC-MSCs的形态学变化,能否表达鼻黏膜上皮细胞特异性蛋白,对放疗后鼻黏膜上皮细胞的趋化作用,hUC-MSCs条件培养液对鼻黏膜上皮细胞增殖的影响等指标,探讨hUC-MSCs修复鼻黏膜放射性损伤的机制。结果:Ad-GFP标记hUC-MSCs在注射后3天和10天冰冻切片荧光显微镜可直接观察到标记细胞,注射后20天仅能通过免疫荧光染色检测到GFP蛋白,主要位于黏膜固有层,不能表达β-Tubulin蛋白。人鼻黏膜上皮细胞与hUC-MSCs直接共培养,部分hUC-MSCs形态发生变化,可表达上皮细胞特异蛋白角蛋白。hUC-MSCs对放疗后鼻黏膜上皮细胞有趋化,hUC-MSCs条件培养液可促进鼻黏膜上皮细胞增殖。结论:hUC-MSCs可能通过旁分泌机制促进豚鼠放射性损伤鼻黏膜粘液纤毛系统功能恢复。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 汤凌浩;洪岭;吕梅;别旭;何桂丽;;重组人表皮生长因子对鼻黏膜结构的影响[J];现代医药卫生;2007年12期
2 周莉妤;鄂淑云;周莉婷;杨丽佳;;鼻黏膜给药的研究进展[J];中国现代药物应用;2009年04期
3 潘嘉;鼻黏膜毒性研究进展[J];西北药学杂志;2005年02期
4 高怡;裴秋玲;韩光;;维生素B_(12)鼻用凝胶剂对鼻黏膜刺激性的观察[J];山西医科大学学报;2005年06期
5 燕志强;高盛宏;张俊;邵晓莉;洪锦科;李得本;;正常人群鼻黏膜中组胺受体亚型的表达[J];中国耳鼻咽喉头颈外科;2011年09期
6 戚春彦;;凡士林在预防吸氧患者鼻黏膜干燥中的作用[J];中国实用医药;2012年23期
7 赵莹,张大卫,郑爱萍,于少云,武凤兰;7种吸收促进剂的鼻黏膜毒性及评价方法[J];北京大学学报(医学版);2004年04期
8 徐丹;朱照静;;影响药物鼻黏膜吸收的因素[J];中国新药杂志;2007年16期
9 葛卫红;张继稳;韩玉环;石森林;林洁;;猪鼻黏膜作为鼻腔给药离体实验用黏膜的可行性实验研究[J];中华中医药学刊;2008年01期
10 刘晓玲;邢志敏;余力生;董建强;邓芙蓉;;大气可吸入颗粒物致大鼠鼻黏膜急性损伤的研究[J];临床耳鼻咽喉头颈外科杂志;2008年02期
11 朱新华;刘月辉;;鼻腔应用类固醇激素对鼻黏膜辐射性损伤组织形态学变化的影响[J];临床耳鼻咽喉头颈外科杂志;2009年08期
12 苏柘僮;杨明;吴品江;许润春;高亚男;杨争;;胆酸-羟丙基-β-环糊精包合物的物相鉴别及体外鼻黏膜渗透评价[J];中草药;2009年06期
13 江满杰;王志颐;吴晋蓉;张勇;周玫;王天友;李泽卿;王秋萍;;长期抗原刺激鼻致敏豚鼠模型的鼻黏膜细胞外基质变化[J];临床耳鼻咽喉头颈外科杂志;2013年05期
14 江满杰;张勇;吴晋蓉;王志颐;王天友;周玫;王秋萍;;基质金属蛋白酶9/组织金属蛋白酶抑制剂1在鼻致敏豚鼠模型鼻黏膜重塑中的作用[J];医学研究生学报;2014年01期
15 肖芒,胡孙宏,刘月辉;辐射对豚鼠鼻黏膜组织形态上的影响[J];中华放射医学与防护杂志;2004年01期
16 陈玉,贺广湘;β-防御素与鼻黏膜免疫[J];国外医学.耳鼻咽喉科学分册;2005年02期
17 朱建国;赵小冬;雷菲;赵丹;;水通道蛋白亚型1~5在人鼻黏膜中定位及意义[J];中国老年学杂志;2009年02期
18 王成硕,董震;防御素与鼻黏膜免疫[J];中华耳鼻咽喉科杂志;2003年02期
19 郑春泉;刘颖;冉鹏;王正敏;;辣椒素局部应用对小鼠鼻黏膜影响的形态学观察[J];中国眼耳鼻喉科杂志;2003年06期
20 封新荣;张红霞;刘英;魏涛;杨玉华;;低温等离子射频消融下鼻甲对鼻黏膜功能的影响[J];中国耳鼻咽喉头颈外科;2006年05期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 汤建国;;放射性鼻黏膜损伤后组织纤维化重塑的特点[A];华东六省一市耳鼻咽喉-头颈外科学术会议暨2008年浙江省耳鼻咽喉-头颈外科学术年会论文汇编[C];2008年
2 胡孙宏;肖芒;汤建国;;鼻腔局部应用皮质类固醇激素对鼻黏膜辐射性损伤的防护作用实验研究[A];浙江省医学会耳鼻咽喉科学分会成立60周年庆典暨2011年浙江省医学会耳鼻咽喉头颈外科学学术年会论文汇编[C];2011年
3 邹坚定;;下鼻甲等离子消融术对鼻黏膜组织学及纤毛功能改变的初步研究[A];2012年浙江省耳鼻咽喉科学学术年会论文集[C];2012年
4 汪际云;胡宝华;王晓伟;黄春鑫;苗英;乐东海;李克强;张顺;;鼻黏膜中Toll样受体5的表达[A];浙江省医学会耳鼻咽喉科学分会成立60周年庆典暨2011年浙江省医学会耳鼻咽喉头颈外科学学术年会论文汇编[C];2011年
5 肖芒;汤建国;姜秀文;;辐射损伤后大鼠鼻黏膜早期组织重塑的特点[A];2007浙江省耳鼻咽喉—头颈外科学术会议论文汇编[C];2007年
6 尹根蒂;熊观霞;赵充;陈媛媛;;鼻咽癌适形调强放射治疗对鼻黏膜-纤毛输送功能影响的临床分析[A];第六届全国鼻咽癌学术大会论文汇编[C];2010年
7 陈洁;;双辛滴鼻液对鼻黏膜作用观察(摘要)[A];第四届全国中西医结合耳鼻咽喉科学术会论文汇编[C];2003年
8 贾建伟;杨积明;李谦;马莹;赵洁;袁桂玉;曹武奎;;甜瓜蒂经鼻黏膜给药治疗顽固性黄疸[A];第一次全国中西医结合传染病学术会议论文汇编[C];2006年
9 张克军;成娜莎;刘俊杰;刘太琴;王宁;王斌全;;实验性AR小鼠鼻黏膜嗜酸性粒细胞浸润程度影响因素探讨[A];中华医学会2011年全国变态反应学术会议论文集[C];2011年
10 杨秀海;李源;;LPS/TLR4/NF-κB信号传导通路及效应蛋白INF-γ和IL-4在鼻黏膜组织中的表达及意义[A];中华医学会第十次全国耳鼻咽喉-头颈外科学术会议论文汇编(下)[C];2007年
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 段洪刚;脐带间充质干细胞修复鼻黏膜放射性损伤的效果和机制研究[D];复旦大学;2014年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王瑾;18β-甘草次酸对脂多糖诱导鼻黏膜炎症的影响[D];中国人民解放军医学院;2015年
2 邓鹏;丙酸氟替卡松对豚鼠鼻黏膜辐射损伤的影响[D];广西医科大学;2005年
3 王刚;丁卡因对急性分离的豚鼠鼻黏膜纤毛运动的影响[D];中国人民解放军军医进修学院;2008年
4 张友岩;聚焦超声对鼻黏膜形态和黏液纤毛系统清除功能影响的实验研究[D];重庆医科大学;2007年
5 梅丹;磷酸川芎嗪鼻黏膜给药系统的研究[D];沈阳药科大学;2008年
6 刘建国;变应性鼻炎鼻黏膜组织病理特征的实验研究[D];南昌大学;2008年
7 刘军;射频热凝治疗变应性鼻炎对血清与鼻黏膜中神经肽的影响[D];桂林医学院;2011年
8 张慧;不同时间预防治疗对变应性鼻炎豚鼠鼻黏膜STAT6、IL-4表达的影响[D];郑州大学;2012年
9 栗子芳;鼻咽癌及放射治疗与鼻黏膜一氧化氮合酶关系的研究[D];广西医科大学;2006年
10 陈薇;慢性鼻窦炎鼻黏膜中糖原合成酶激酶3β与PI3K/Akt及白细胞介素6间的相关性[D];南昌大学医学院;2013年
中国重要报纸全文数据库 前9条
1 山东中医药高等专科学校 祝建材;护好鼻黏膜有助防感冒[N];中国中医药报;2013年
2 西安交大医学院第一附属医院 副教授 张美丽;健鼻巧防病[N];家庭医生报;2009年
3 ;另辟蹊径天地新[N];中国医药报;2004年
4 健康时报特约记者 杨璞;初冬开始防三干[N];健康时报;2010年
5 刘江峰;鼻涕中带血是怎么回事[N];民族医药报;2006年
6 宇光;鼻子干用热水熏熏[N];卫生与生活报;2006年
7 刘江峰(主治医师);鼻涕中带血是怎么回事[N];上海中医药报;2005年
8 金慰鄂;滴鼻有方疗效好[N];医药养生保健报;2007年
9 主治医师 晓峰;鼻涕中带血不可小视[N];保健时报;2006年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978