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LAIRs和胶原分子调节人早孕蜕膜NK细胞功能的分子机制

付强  
【摘要】:妊娠是一个独特的免疫学事件。妊娠成功需要通过精细的母-胎对话,在母-胎界面建立独特的免疫耐受微环境。母-胎界面多种细胞和分子之间的对话是母-胎调节的核心内容,解析其中的免疫细胞,滋养细胞和蜕膜基质细胞通过它们表面膜分子和分泌的细胞因子之间的相互作用,是阐明母-胎免疫耐受机制的重要研究内容,不仅对生殖免疫学,而且对肿瘤和移植免疫学都具有重要的理论和临床意义。白细胞相关免疫球蛋白样受体(LAIR)是新近鉴定的以胶原为配体的免疫受体。LAIR-1广泛表达在造血细胞和各类免疫细胞表面,胞质区有ITIM基序,LAIR-1对外周血免疫细胞功能的调节作用及其在肿瘤免疫和移植免疫中的意义是免疫学研究的热点。然而,在生殖免疫学中,目前还没有任何相关研究。胶原蛋白作为母-胎界面含量丰富的重要细胞外基质,在妊娠维持以及免疫调节中的作用研究也甚少。蜕膜NK细胞约占蜕膜免疫细胞总数的70%,其表型和生物学行为对母-胎免疫耐受的形成发挥着至关重要的作用。本研究在分析了LAIRs和胶原分子在母-胎界面的表达及其和自然流产关系的基础上,从LAIR-1和胶原分子的相互作用对在母-胎界面占绝对组成优势的早孕期NK细胞的调控入手,以解析滋养细胞和蜕膜基质细胞通过表达的胶原蛋白和LAIRs的相互作用对NK细胞表型和生物学行为的调节,并进一步研究JAK-STAT信号通路在此调节中的角色。研究成果可以为临床上全面理解自然流产等母-胎免疫调节紊乱性疾病提供新的视角,同时对相关疾病的诊断和防治也可提供新的靶点和思路。第一部分LAIR-1和胶原分子的表达水平与自然流产相关目的分析比较LAIR家族成员(LAIRs)和胶原分子在正常和异常妊娠组织中的表达;以及在体外培养的正常和流产的滋养细胞,蜕膜基质细胞和NK细胞中的表达。方法收集正常和异常妊娠早孕期妇女的绒毛和蜕膜组织,采用马松染色法(Masson)和免疫组化技术(IH)分析LAIR-1和胶原分子在其中的表达情况;分离各种早孕期滋养细胞,蜕膜基质细胞(DSC)和蜕膜免疫细胞(DIC),采用多聚酶链式反应(PCR),酶联免疫吸附(ELISA)等技术分析以上细胞中多种LAIRs和胶原分子表达的情况;用流式细胞术(FCM)分析正常和流产组织蜕膜NK细胞LAIR-1的表达。结果获得了较全面的LAIRs和胶原分子在正常妊娠和自然流产组织中的表达情况。对比分析结果显示:正常妊娠的绒毛和蜕膜组织相对于自然流产的绒毛和蜕膜组织,都有更高水平胶原的表达;体外培养的正常滋养细胞、蜕膜基质细胞在mRNA和蛋白水平也都比自然流产的滋养细胞、蜕膜基质细胞表达分泌更高水平的胶原蛋白;正常妊娠的蜕膜组织比自然流产的蜕膜组织表达更高的LAIR-1,并且正常妊娠的蜕膜NK也比自然流产的蜕膜NK细胞表达更高水平的LAIR-1。结论 人早孕期母-胎界面滋养细胞和蜕膜基质细胞的胶原蛋白表达下降和自然流产具有相关性;蜕膜组织和蜕膜NK细胞LAIR-1的低表达与自然流产也有相关性。第二部分LAIRs和胶原分子相互作用调节NK细胞表型目的解析LAIR-1和胶原分子相互作用的特点,及其对外周NK细胞及蜕膜NK细胞表面受体和细胞内细胞因子表达的调节作用。方法常规无菌分离外周血单个核细胞(PBMC)和蜕膜免疫细胞(DIC)后,磁珠分选其中的外周NK细胞和蜕膜NK细胞,并在其体外培养体系中加入不同浓度的胶原分子,用多聚酶链式反应(PCR)和流式细胞(FCM)技术分析胶原分子受体LAIR-1的表达情况;进一步在早孕期NK细胞培养体系加入胶原蛋白分子,并且设立LAIR-2处理组,用FCM分析NK细胞表面的激活性受体和抑制性受体以及细胞内Thl、Th2型细胞因子和杀伤活性相关分子的表达。结果 胶原蛋白分子可以剂量依赖性的方式诱导其受体LAIR-1在NK细胞mRNA和蛋白水平表达增加。胶原蛋白分子可以通过和LAIR-1的相互作用降低蜕膜NK细胞表面激活性受体NKp30的表达,上调抑制性受体KIR2DL1的表达;胶原蛋白分子和LAIR-1的相互作用也可以降低蜕膜NK细胞Thl型细胞因子IFN-γ口TNF-a的表达,而不影响蜕膜NK细胞Th2型细胞因子IL-4和IL-10的表达;高浓度胶原蛋白分子可以降低蜕膜NK细胞穿孔素的表达,且后者的表达和]LAIR-1表达的荧光强度成反比,这种作用以及胶原蛋白分子对NK细胞表型和Thl型细胞因子表达的调节都可以被LAIR-2所拮抗。结论胶原分子上调NK细胞中LAIR-1的表达,并且通过和LAIR-1的相互作用可以降低NK细胞Th1型细胞因子和穿孔素的表达,诱导蜕膜NK细胞的耐受表型。第三部分 滋养细胞和蜕膜基质细胞通过胶原分子参与调节蜕膜NK细胞的功能目的解析人早孕期母-胎界面的滋养细胞和蜕膜基质细胞通过表达的胶原蛋白分子对蜕膜NK细胞表型的调节作用。方法在体外建立人早孕期滋养细胞,蜕膜基质细胞单独培养、以及滋养细胞和蜕膜基质细胞共培养体系来模拟早孕期母-胎界面微环境,然后与纯化的蜕膜NK细胞共培养,并设立LAIR-2处理组,用流式细胞术(FCM)分析蜕膜NK细胞的表面激活性受体和抑制性受体以及细胞内细胞因子和杀伤活性相关分子的表达。进一步用P4H shRNA质粒转染滋养细胞与蜕膜基质细胞来模拟自然流产的母-胎界面胶原蛋白分子低水平表达的微环境,用多聚酶链式反应(PCR)、酶联免疫吸附(ELISA)方法和氨基酸分析仪检测转染处理后,滋养细胞、蜕膜基质细胞单独培养和共培养体系中胶原蛋白的表达水平;然后用FCM分析蜕膜NK细胞表面的激活性受体和抑制性受体以及细胞内细胞因子和杀伤活性相关分子的表达。结果滋养细胞和蜕膜基质细胞可以通过分泌胶原分子与LAIR-1相互作用降低蜕膜NK细胞表面激活性受体NKp30的表达,上调抑制性受体KIR2DL1的表达;也可以降低蜕膜NK细胞Thl型细胞因子IFN-y和]TNF-a,以及穿孔素的表达。用LAIR-2阻断和P4H shRNA质粒转染以基因沉默胶原合成,都能够抑制滋养细胞与蜕膜基质细胞对蜕膜NK细胞的表面受体、细胞内细胞因子以及杀伤活性的调节作用。值得一提的是,用P4H shRNA质粒转染滋养细胞与蜕膜基质细胞会使蜕膜NK细胞Th2型细胞因子IL-4和IL-10的表达水平下降。结论人早孕期滋养细胞和蜕膜基质细胞可以通过表达的胶原分子参与调节蜕膜NK细胞的功能,从而有利于正常妊娠的维持。第四部分JAK-STAT信号通路参与LAIR-1对NK细胞的调节作用目的解析LAIR-1调节NK细胞功能的信号通路。方法在纯化的外周NK细胞(pNK)和蜕膜NK细胞(dNK)的体外培养体系中加入胶原蛋白分子;用shRNA转染的滋养细胞和蜕膜基质细胞共培养的上清(Culture Medium, CM)培养NK细胞后,用免疫蛋白印迹实验(Western Blot)分析LAIR-1和AK-STAT信号通路中STAT1、p-STAT1、STAT4、p-STAT4的表达,进一步用Western Blot和流式细胞术(FCM)分析JAK-STAT信号通路下游相关转录因子T-bet和Helios等的表达;用免疫共沉淀技术(CoIP)分析JAK-STAT信号通路上游相关分子JAK1、JAK2和SHP-1的相互关系,以及SHP-1和LAIR-1的相互作用关系。用病毒质粒构建LAIR-1过表达的稳转细胞株NK-92-LAIR-1,并且通过QPCR、Western Blot和荧光显微镜进行鉴定,进一步对其在活化状态下STATs和LAIR-1的表达进行初步分析。结果在胶原蛋白分子的刺激下,LAIR-1可以募集SHP-1,并通过后者和JAK1、JAK2的直接作用,对JAK-STAT信号通路中STAT1、STAT4的活化发挥抑制作用,进而影响转录因子T-bet和Helios等的表达;成功地构建了LAIR-1过表达的稳转细胞株NK-92-LAIR-1.结论JAK-STAT信号通路参与LAIR-1和胶原分子相互作用对NK细胞的调节作用。LAIR-1过表达稳转细胞株的建立为我们后期进行深入系统的相关研究工作打下了坚实的基础。


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