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子痫前期与HLA-G相关的发病机制及其子代大脑发育和功能的研究

刘学渊  
【摘要】:子痫前期是人类妊娠期特有的多系统、多器官损伤的疾病。该病在孕妇中的发生率大概为3-5%,发展中国家比例更高。经典的子痫前期是以妊娠20周以后出现高血压,尿蛋白等症状为主要特征。该疾病已经成为主要危害了母婴健康甚至引起死亡的妊娠期疾病。目前的研究表明,胎盘着床不足是子痫前期疾病发生的重要特征。而滋养层细胞侵袭不足是导致胎盘浅着床的一个重要原因。滋养层细胞是胚胎与母体直接接触的部分,包括细胞滋养层细胞、合体滋养层细胞和绒毛外细胞滋养层细胞三个亚群。滋养层细胞侵入母体蜕膜层不被母体排斥而快速增殖是妊娠成功的关键因素之一。以往的研究已经表明表达在滋养层细胞中的人类白细胞抗原G(human leukocyte antigen-G, HLA-G)在胚胎成功着床过程中扮演着重要的角色。滋养层细胞中HLA-G表达下降会导致多种妊娠期疾病包括子痫前期。HLA-G基因是非经典的主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex, MHC)Ⅰ类分子。现在已知,HLA-G可以通过多种机制诱导母胎间免疫耐受,尤其是对母胎界面中的免疫活性细胞如NK细胞、T细胞、抗原提呈细胞等的调节作用,从而使胚胎免遭受蜕膜NK细胞和T淋巴细胞的攻击。但是我们依然不清楚HLA-G是否可以不依赖于免疫调节作用单独作用于滋养层细胞的生物学行为以及其调控机理。这些将有助于我们深入了解子痫前期发病机理,有助于我们对该疾病的预防和治疗。所以,在本论文的第一部分,我们通过调节在JEG-3细胞中HLA-G的表达来研究其功能及其机制。然而,目前的研究仍无法提供有效的治疗和预防子痫前期疾病发生的措施。子痫前期作为人类孕期特有的疾病,不仅影响母亲的身体健康也严重的影响了其子代的发展。流行性病学调查研究表明子痫前期患者的子代在其成年后易发生发育性呼吸窘迫综合症,高血压,中风等疾病。所以有必要建立子痫前期疾病的动物模型以有利于进一步理解子痫前期的发病机理和其对子代的影响。之前的研究表明对动物进行No)硝基L精氨酸甲酯(Nω-Nitro-L-Arginine Methy Ester,L-NAME)处理(一种一氧化氮合成抑制剂)可以导致子痫前期样特征的产生。之前的研究主要集中在子痫前期子代的肺、肾脏、血管内皮细胞发育和功能的研究。而子痫前期发病的时间恰是胚胎大脑发育的关键时期。在本论文的第二部分中,我们使用了妊娠14.5天的Sprague-Dawley大鼠来阐明子痫前期样大鼠模型中子代鼠大脑发育及功能变化及其可能的机制。第一部分HLA-G调控JEG-3侵袭力的细胞信号通路的研究目的通过上调和下调HLA-G在JEG-3细胞中的表达,研究其不依赖于与免疫细胞相互作用,在调节JEG-3细胞生物学行为中的功能及其分子机制。方法用转染HLA-G特异性siRNA来下调HLA-G的表达。用外加human galectin-1的方法上调HLA-G的表达。用transwell的方法观察上调和下调HLA-G表达后,JEG-3细胞的侵袭力。用Brdu急性掺入法及PH3标记法观察下调HLA-G表达后JEG-3细胞的增殖情况,activated cleaveage caspase3标记法观察下调HLA-G表达后JEG-3细胞的凋亡情况。用Western blot的方法研究HLA-G被上调和下调后STAT3磷酸化程度的变化。外加白介素6(interleukin-6,IL-6)来研究其能否恢复HLA-G被下调后STAT3磷酸化程度和JEG-3细胞的侵袭力。结果 1)在HLA-G表达下调后,JEG-3细胞的增殖凋亡没有发生明显变化但是其侵袭能力明显下降。2)下调HLA-G表达后,信号传导和转录激活因子(signal transducer and activator of transcription3, STAT3)的磷酸化程度明显下降。3)使用人类凝集素1 (human galectin-1)处理JEG-3细胞可以上调HLA-G表达,促进STAT3的活化,并且增加JEG-3细胞侵袭能力。4)发现IL-6,但不是human galectin-1可以通过提高STAT3磷酸化程度来恢复HLA-G下调后引起的侵袭力下降。结论这一结果揭示了STAT3磷酸化程度是HLA-G直接调节JEG-3细胞的侵袭力的关键生物学事件。这是HLA-G(?)表达导致子痫前期发生的原因。第二部分子痫前期样大鼠子代大脑发育和功能的研究目的构建子痫前期样大鼠模型,并研究子痫前期样的大鼠子代大脑发育和功能是否受到影响及其细胞和分子机制。方法把妊娠的母鼠随机分成两组。实验组从妊娠14.5天到21天喂食含50mg·kg-1·d-1L-NAME的水,对照组喂食清水。用血压和尿蛋白测定来确定模型的建立。用免疫组化方法来研究P0仔鼠大脑发育状况。用水迷宫实验来研究8周龄雄性子代鼠的空间学习记忆能力。用免疫组化的方法来研究8周龄雄性子代鼠大脑的结构及发育情况。用realtime PCR的方法检测神经元生成相关基因的表达情况。并用BSP方法检测相关基因的甲基化状态。用Western blot的方法检测了学习记忆LTP相关蛋白的表达状况。结果 1)成功构建子痫前期样大鼠模型。2)发现子痫前期样大鼠子代P0仔鼠体重和脑重比正常的大鼠子代的小,但脑-体重比没有明显的变化。 3)PO仔鼠皮层的放射状胶质细胞形态、分化、凋亡情况没有明显的变化,但神经细胞发生层的增殖能力明显的下降,增殖相关的基因(Fgf2,Creb和Ep300)也有明显下调。4)发现8周龄子痫前期样大鼠子代的大脑皮层板层结构和皮层厚度没有明显变化,并且脑重和体重都明显的回复到正常组大鼠子代的水平。5)发现8周龄的子痫前期样大鼠子代的空间学习和记忆能力低于正常组。6)分析学习记忆相关的细胞和分子机理,初步发现在子痫前期样大鼠子代的胶质细胞有显著增生,并且成年海马新生神经元的生成能力变弱,增殖相关的基因表达(Fgf2)有显著性变化。7)发现Fgf2,Creb和Ep300基因启动子区甲基化程度无变化。8)发现LTP相关蛋白ERK, JNK在表达和磷酸化水平都无变化。结论我们的结果表明子痫前期样大鼠子代的大脑发育和功能受到明显的影响。主要表现在早期大脑神经元发生滞后。成年后胶质增生,海马区神经干细胞增殖能力的下降。这些有可能是导致其空间学习记忆能力较差的原因。同时我们的结果表明促进成年个体海马新生神经元的增殖能力有可能是提高子代学习记忆能力的重要靶方向。


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