Sirt1对5/6肾切除大鼠的保护作用及相关机制探讨

【摘要】：第一部分Sirtl激动剂Resveratro1对5/6肾切除大鼠的保护作用和TGF-β/Smad信号通路的影响目的纤维化在慢性肾脏病的发生发展中起着重要的作用,Resveratrol (RSV)可以激活去乙酰酶Sirtl,并具有抗氧化和抗纤维化的特性。本文观察RSV对5/6肾切除大鼠肾脏的保护作用及对TGF—β/Smad信号通路的影响。方法雄性SD大鼠180-200g,二步法建立5/6肾切除模型,随机分为三组：A：假手术组(Sham组)；β：5/6肾切除组(Nx组)；C；5/6肾切除+RSV治疗组(Nx+RSV组),术后1周开始给予生理盐水或RSV(20mg·kg-1·d-1)灌胃至术后12周。建模后每四周使用代谢笼收集24h尿液检测24h尿蛋白定量,0、4、8、12周测大鼠尾动脉血压,12周后腹腔麻醉动物,腹主动脉采血检测血肌酐(SCr),尿素氮(BUN)。肾组织固定、切片后行PAS.MASSON染色观察肾脏病理变化,TGF-β、CTGF、Fibronectin、Collagen-I、α-SMA免疫组织化学染色观察各组大鼠纤维化改变。Western blot和Realtime PCR检测Fibronectin.Collagen-I.TGF-β、Smad3和磷酸化Smad3水平。免疫共沉淀检测Sirtl与乙酰化Smad3的相互作用。结果(1)与Sham组相比,Nx组在术后12周尿蛋白显著增加(152.14±30.48 mg/day vs 25.34±7.54 mg/day),伴肾功能减退：血肌酐(111.6±21.5μmol/L vs 53.9±11.6μmol/L)和血尿素氮(16.75±3.99 mmol/L vs 8.03±1.2 mmol/L)水平升高。RSV治疗显著减轻尿蛋白(79.87±34.27 mg/day),降低血肌酐(83±14.69μmol/L)和血尿素氮(11.95±1.88 mmol/L)水平。Nx组大鼠尾动脉血压较Sham组显著升高,RSV可以降低大鼠尾动脉血压(P0.05)。(2)肾小球硬化指数和小管间质纤维化指数在Nx组显著增加(1.56±0.34 vs 0.35± 0.08；1.47±0.29 vs 0.18±0.04), RSV治疗显著改善肾小球硬化指数和小管间质纤维化指数。(3)免疫组化、Western blot和Realt ime PCR结果显示Nx组大鼠Fibronect in.Collagen-Ⅰ和TGF-β的表达较Sham组均上调,而RSV治疗能显著下调Fibronectin、Collagen-Ⅰ和TGF-β的表达。(4)Western blot结果显示Nx组大鼠磷酸化Smad3的表达较Sham组显著升高,但RSV治疗并未显著改善磷酸化Smad3的升高。免疫共沉淀研究结果显示Sirt1与Smad3相互作用,Nx组大鼠Sirt1与乙酰化Smad3结合较Sham组下降,RSV治疗能显著改善Sirt1与Smad3结合,并且RSV治疗能下调Nx组大鼠升高的乙酰化Smad3水平。结论本研究结果显示RSV可能通过下调5/6肾切除大鼠TGF-β和乙酰化Smad3的表达,从而改善5/6肾切除大鼠肾功能、蛋白尿、肾脏病理和纤维化等指标,其作用可能与激活Sirt1有关。第二部分Sirt1对TGF-β诱导的小鼠系膜细胞的保护作用和TGF-β/Smad信号通路的影响目的研究Sirt1对TGF-β诱导的小鼠系膜细胞的保护作用和TGF-β/Smad信号通路的影响。方法(1)体外培养小鼠肾小球系膜细胞(MMC),分别给予不同浓度(0、1、 2、5ng/mL)和不同时间(0、6、12、24h)的TGF-β诱导MMC后提取细胞蛋白,Western blot和Realtime PCR检测Fibronectin、Collagen-Ⅰ表达。2ng/mL的TGF-β诱导MMC,并予不同浓度的RSV (10、25、50μM)干预MMC24h后提取细胞蛋白并检测Fibronectin、Collagen-Ⅰ的表达。(2)分别采用以慢病毒为载体的RNA干扰或过表达技术转染体外培养的MMC,并予TGF-β刺激,RSV干预24-48h后提取细胞蛋白,Western blot检测Sirt1、Fibronectin、Collagen-Ⅰ的表达。(3)体外培养MMC,分别予0、1、2ng/mL的TGF-β诱导MMC,并予10、25μM的RSV干预MMC 3h后提取细胞蛋白,Western blot检测Smad3、磷酸化Smad3和乙酰化Smad3的表达,免疫共沉淀检测Sirt1与Smad3的相互作用。(4)采用以慢病毒为载体的RNA干扰技术转染体外培养的MMC,并予TGF-β刺激3h后提取细胞蛋白,Western blot检测Sirt1的表达,免疫沉淀法检测Smad3和乙酰化Smad3的表达。(5)采用以慢病毒为载体的RNA干扰转染体外培养的MMC,同时转染pRL-TK质粒和Smad3/4-responsive promoter p (CAGA) 12-Luc if erase质粒,当转染并同步化16h后给予TGF-β刺激,RSV干预,24h后按照荧光素酶启动子基因测定试剂盒操作步骤测定p (CAGA) 12荧光素酶的活性。结果(1)在体外培养的MMC中,TGF-β的诱导可呈时间与剂量依赖性上调Fibronectin、Collagen-Ⅰ的表达,RSV干预可显著下调TGF-β诱导的Fibronectin、Collagen-Ⅰ的表达,其作用呈剂量依赖性。(2)RSV显著下调TGF-β诱导MMC的Fibronectin、Collagen-Ⅰ的表达,采用慢病毒转染RNA干扰技术下调Sirt1的表达则显著减轻RSV的保护作用,而采用过表达技术上调Sirt1的表达则显著减轻TGF-β诱导的Fibronectin、 Collagen-Ⅰ的表达,提示RSV的作用与激活SIRT1有关。(3)在体外培养的MMC中,TGF-β的诱导可显著上调乙酰化Smad3和磷酸化Smad3的表达,RSV干预可下调TGF-β诱导的乙酰化Smad3表达,而对磷酸化Smad3的表达影响不大。免疫共沉淀结果显示RSV干预可增加Sirt1与Smad3结合。(4)采用慢病毒转染RNA干扰技术下调Sirt1的表达可增加TGF-β诱导MMC乙酰化Smad3表达,这与Sirt1的去乙酰化功能相一致。(5)在体外培养的MMC中,RSV能减少TGF-β诱导的Smad3启动子荧光素酶的活性。采用慢病毒转染RNA干扰技术下调Sirt1的表达则显著减轻RSV的这种作用。结论本研究结果显示RSV可下调TGF-β诱导MMC的Fibronectin、Collagen-Ⅰ的表达和Smad3启动子荧光素酶的活性,其作用可能与激活Sirt1,下调乙酰化Smad3,降低Smad3转录活性有关。第三部分Sirtl敲除的杂合子(Sirt1+/-)小鼠与野生型(Sirt1+/+)小鼠对5/6肾切除的耐受性目的观察Sirtl敲除的杂合子(Sirtl+/-)小鼠与野生型(Sirtl+/+)小鼠对5/6肾切除的蛋白尿、肾功能、肾脏病理和纤维化等指标的影响。方法雄性Sirt1+/-小鼠与Sirt1+/+小鼠18-20g,二步法建立5/6肾切除模型,随机分为四组：A:Sirt1+/+假手术组(WT-Sham组);B:Sirtl+/-假手术组(KO-Sham组);C:Sirt1+/+5/6肾切除组(WT-Nx组);D:Sirt1+/-5/6肾切除组(KO-Nx组)。建模后每四周使用代谢笼收集24h尿液检测24h尿蛋白定量,术后12周腹腔麻醉动物,腹主动脉采血检测血尿素氮(BUN)。肾组织固定、切片后行PAS.MASSON染色观察肾脏病理变化,TGF_β、Collagen-Ⅰ、α-SMA免疫组织化学染色观测各组大鼠纤维化改变。Western blot检测Fibronectin. Collagen-Ⅰ和Sirt1的表达。结果(1)与WT-Sham组相比,WT-Nx组在术后12周尿蛋白显著增加,伴血尿素氮水平升高(P0.05)。而KO-Nx组尿蛋白和血尿素氮水平较WT-Nx组升高更明显(P0.05)。(2)WT-Nx组肾小球硬化和小管间质纤维化程度较WT-Sham组明显增加,而KO-Nx组较WT-Nx组纤维化程度更重。(3)免疫组化、Western blot结果显示WT-Nx组小鼠TGF_β、Fibronectin、 Collagen-Ⅰ的表达较WT-Sham组均上调,而KO-Nx组TGF-β、Fibronectin. Collagen-Ⅰ的表达较WT-Nx组升高更明显。结论Sirt1+/-小鼠5/6肾切除后较野生型Sirt1+/+小鼠肾功能恶化更加显著,肾脏病理损伤和纤维化等指标更重,提示下调Sirt1会加重5/6肾切除小鼠的肾损伤。