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蛋白质糖链结构色谱质谱分析新方法研究

王朝凤  
【摘要】:蛋白质的糖基化是最重要的后修饰形式之一,通过糖链的修饰使得蛋白在很多生理过程中扮演着重要角色,科学家们已经发现糖链的组成、丰度的变化与疾病有着密切的联系,因此对糖链结构的研究已经成为糖基化蛋白质组学研究中的重要组成部分。糖链结构具有复杂性、多样性和微不均一性的特点,并且从生命体内获取糖链的数量非常有限,这使其研究面临着巨大的挑战,所以开发新技术新方法实现糖链结构的鉴定具有重要意义。本论文针对糖基化蛋白质组学研究中糖链结构的鉴定和糖蛋白酶解方面的问题,将微分析的新方法新技术与糖基化蛋白质组学的相关研究相结合,开展了一系列的研究工作:建立了适用于微量样品分析的高灵敏的毛细管高效液相与激光诱导荧光检测系统,首次使用并优化了新荧光试剂的糖链标记方法,发展了糖链结构鉴定的分析方法和糖蛋白酶解的新技术。全文共分五章,主要内容如下:第一章,文献综述。本章概述了糖基化蛋白质组学的研究意义及内容,着重介绍了在糖基化蛋白质组学研究中糖链结构分析和糖蛋白酶解方面的研究进展,阐述了本论文选题的目的和意义。第二章,研究了利用酸催化方法实现糖链的可控水解反应。在糖链的结构分析中,首先需要将完整的糖链分解为若干部分水解的糖链片段,之后利用分析鉴定手段完成糖链片段的分析,因此解离过程是糖链组成分析中的重要步骤之一。酸催化可控水解的方法是实现糖链解离的化学方法中的一种,对于还原糖而言,糖链经过酸催化水解后产生了新的还原端,可通过衍生的手段进行修饰,从而为拓展糖链结构分析的新方法提供了前提。本章中采用麦芽七糖、β-环糊精等寡糖作为分析对象,使用MALDI-TOF MS手段测定水解产物,详细研究了不同的酸溶液、加热模式、反应条件对酸催化水解糖链的影响,确定了实现可控酸水解的动态条件范围和水解产物的构成。通过对酸催化糖链可控水解方法的建立,为后续糖链结构分析新方法的开发奠定了基础。第三章,建立了高灵敏的毛细管高效液相与激光诱导荧光检测系统,并建立了寡糖糖链组成分析的新方法。由于糖类在生物体内的获取量非常有限,对其组成的分析也因此面临着巨大的挑战,开发新方法新技术应用于这种低含量物质的测定具有重要的意义。本章中采用常规泵系统、自制的毛细管色谱柱和激光诱导荧光检测器,建立了具有高灵敏度、适于微量样品分析的毛细管高效液相色谱与激光诱导荧光检测系统,从而为实现糖链的微分析建立了仪器条件。由于糖链自身无紫外或荧光基团,而且其在质谱中离子化效率不高,为改善糖链的测定效果,可通过糖链标记的方法来提高糖链在色谱或质谱中的灵敏度。本章以麦芽七糖为研究对象,对比了多种反应类型的衍生试剂对糖链还原端的标记,讨论了各自反应的特点,选择了适用于高灵敏的激光诱导荧光检测器(半导体激光器波长为473 nm)的标记试剂。由于此种荧光试剂在寡糖还原端的衍生方面仍未见报道,为了实现高效的标记糖链,我们将衍生方法进行了优化,讨论了在不同检测模式下衍生条件的差异,筛选了适于激光诱导荧光测定的衍生方法。结合可控酸水解、荧光标记、高灵敏的毛细管高效液相与激光诱导荧光检测系统和质谱多种手段,建立了寡糖组成分析的新方法,为后续糖蛋白中糖链结构的分析鉴定提供了可能。第四章,发展了纯化糖蛋白中糖链的微量样品处理技术,同时还研究了糖蛋白中糖链结构分析的新方法。糖蛋白通过糖链结构的变化影响着生物体正常的生理功能,因此对复杂的糖蛋白中糖链结构的研究具有重要意义。以寡糖糖链分析技术为基础,本章进一步研究了适用于糖蛋白中糖链组成分析的新方法。我们以核糖核酸酶B为研究对象,采用肽N-糖苷酶F (PNGase F)切除糖链,对比了C18 SPE小柱、C18 ZipTip和自制的C18毛细管柱纯化糖链的方法。在研究过程中发现,自制的毛细管小柱对蛋白有很好的保留效果,并且由于自制小柱柱体积小,样品损失少,非常适用于微量样品处理。糖链纯化后,采用荧光试剂进行衍生,利用质谱、液相色谱、毛细管高效液相与激光诱导荧光检测系统进行了糖链的分离和鉴定,之后结合可控酸水解的方法,以糖蛋白中的一条糖链馏分为代表进行了结构分析,最终获得了令人满意的结果,从而为后续分析复杂的实际样品中糖蛋白的糖链做了铺垫。第五章,发展了糖蛋白的快速酶解方法,搭建了在线酶解系统,并将之应用于糖蛋白的快速酶解的分离分析。相对于常用的溶液酶解,固定酶反应器的酶解具有效率高、时间短等特点,在蛋白的酶解过程中具有巨大的优势。以本组已研制的固定酶反应器为基础,发展了其在糖蛋白酶解方面的应用。由于此固定酶反应器采用亲水方法聚合而成,其亲水性的特点易于带有亲水性糖链的糖蛋白的传递,同时能够避免非特异性的疏水相互作用。本章以辣根过氧化物酶作为快速酶解糖蛋白的研究对象,采用MALDI-QIT-TOF MS作为检测手段,测定这种亲水型的固定酶反应器对糖蛋白的酶解效果,对比了溶液和固定酶反应器这两种酶解方法,研究发现后者鉴定到的糖肽的数目要明显优于前者。之后我们搭建了在线毛细管液相酶解系统,实现了对多种糖蛋白的在线酶解及分离。在此基础上,我们又进一步发展了微波辅助固定酶反应器的酶解方法,以一些难于变性的糖蛋白为酶解对象,在短时间内达到了溶液酶解的效果,克服了因其酶解前蛋白链段未完全展开而导致的酶解不完全的缺点。经过多次微波辅助酶解实验,发现此种固定酶反应器在微波条件下仍具有可重复使用的特点,并未见明显的酶活性损失,从而拓展了亲水型固定酶反应器在糖蛋白酶解中的应用。综上所述,本论文针对糖基化蛋白质组学研究中的热点和难点问题,采用酸催化可控水解方法辅助糖链的组成鉴定,确定了适宜的反应条件,实现了寡糖糖链的可控水解。针对糖链组成分析的微量化的特点,搭建了高灵敏的毛细管高效液相与激光诱导荧光检测系统,筛选了适宜的标记试剂,将其首次应用于糖链还原端的一步标记反应中,同时结合酸催化可控水解的方法建立了分析寡糖糖链结构的新方法。在此基础上,发展了糖蛋白中糖链组成分析的新方法,为后续分析复杂的实际样品中糖蛋白的糖链提供了铺垫。此外,我们还利用亲水型的固定酶反应器搭建了在线酶解系统,建立了糖蛋白的快速酶解和微波辅助酶解方法,成功实现了多种糖蛋白的酶解和分离,为深入发展糖蛋白糖链的测定和大规模快速酶解的研究建立了良好的基础。


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