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基于红外辅助提取和现代色谱技术的中药活性成分分析技术应用研究

李发洁  
【摘要】:近些年来,“中药现代化”在中医药界成为人们议论的重要话题和工作内容,更吸引了众多西医药学工作者乃至其他学科工作者的关注。要实现中药现代化,除了中草药的种植和质量监控外,最关键的是中草药的提取、分离过程。近年来,在中药提取方面出现了许多新的提取分离技术(如超声辅助提取、微波辅助提取等),与传统中药有效成分提取分离方法相比,新型的提取分离技术具有明显的优越性,能显著提高有效成分的收率和纯度。因此,运用新提取技术研究中药,是实现中药现代化的重要途径,必将为中药现代化研究注入新的活力。本课题针对中药现代化研究中关键的中药成分提取分析技术这一热点难点问题,以红外辅助提取-色谱分析技术为基础,以发展相关高提取率、快速便捷的新技术新方法并进行实际的应用研究为目标,以槐米等中药为研究对象,建立了多种提取分离分析新方法,并通过一系列的方法验证和技术比较,为发展高选择性、高效、快速、环保的中药成分分析新技术提供了新颖的思路和可靠的应用研究。主要研究内容和取得的主要研究成果摘要如下:第一章概述了中药成分提取分析技术尤其是中药有效成分提取分析方法的发展对中药现代化及中药质量标准研究的重要意义,简单介绍了中药成分分析中传统的几种前处理方法,概述了超声辅助提取、微波辅助提取、固相微萃取、红外辅助提取等几种现代提取分离技术的基本原理特点及其在中药成分分析中的应用,最后提出了本论文选题的目的和意义。第二章针对传统正交实验等只能对一个个孤立的实验点进行分析的缺陷,首次采用红外辐射作为热源,以槐米中的芦丁为研究对象,建立了中药活性成分红外辅助提取的响应面优化方法。通过单因素试验,影响芦丁提取率的主要参数(包括甲醇浓度,料液比,提取时间和红外功率)的范围得到了确定。然后采用Box-Behnken设计,得到一个回归模型以预测芦丁的最佳提取率。ANOVA分析表明,回归方程与实际情况非常吻合。最佳工艺条件如下:红外功率204.90 W,液/固比30.00 mL/g,甲醇浓度70.00%,提取时间4.80 main。在最佳条件下,理论预测的芦丁最大产量(125.70 mg/0.5 g槐米)与实验值(126.32士0.67 mg/0.5 g槐米,n=3)相符,表明了响应面分析在槐米中芦丁的红外辅助提取优化中是可靠的和可行的。随后,以红外辅助提取厚朴中的厚朴酚及和厚朴酚为例,对响应面优化法同时应用于中药中多种成分的红外辅助提取优化时的情况进行了探讨。结果表明,响应面优化法不仅可以应用于中药中一种成分的红外辅助提取优化,还可以同时应用于中药中多种成分的红外辅助提取优化过程当中。(本章研究成果已发表在Phytochemical Analysis (2012,23:292-298), IF:2.633,第一作者)第三章针对传统上通常使用一些有毒的有机溶剂进行提取的问题,首次采用红外辐射作为热源及更为绿色环保的非离子型表面活性剂,以胡黄连中的胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ为研究对象,建立了中药活性成分的红外辅助非离子型表面活性剂提取方法。在最佳条件下,即10%Genapol X-080(v/v),液/固比150:1(mL/g),红外功率200 W,提取时间4 min,提取率达到最高值。与各种极性和非极性溶剂(纯水,无水乙醇,丙酮,乙酸乙酯和正己烷)相比,10% Genapol X-080的提取率更高(p0.05)。采用红外辅助非离子型表面活性剂提取所得胡黄连苷的量显著高于采用常规超声辅助提取和加热回流提取的方法(p0.05)。随后通过浊点萃取(CPE)对胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ进行了富集研究,所得的最终浓缩因子为5,这在胡黄连苷等中草药活性成分的大规模提取和纯化中可能是有价值的。本章实验结果表明,红外辅助非离子型表面活性剂提取是用于胡黄连中药理活性成分快速提取和富集浓缩的一个高效、绿色的分析制备技术。(本章研究成果已发表在Analytical Methods(2013,5:3747-3753), IF:1.855,第一作者)第四章首次采用红外辐射作为热源,建立了一个环保且简单、快速的无溶剂提取方法——红外蒸馏-顶空固相微萃取/气相色谱-质谱法(IRD-HS-SPME/GC-qMSD),并用该法对来自槐树的两种著名中药(槐米和槐角)中的挥发性成分进行了提取测定及对比分析。槐米和槐角因其所具有的药理活性、丰富的资源、较低的毒性和成本而得到广泛使用。它们的主要活性成分包括挥发油和黄酮类化合物等。目前针对它们的研究大多集中于黄酮类物质,很少有针对挥发油的报道,而挥发油因其功能特性可用于食品的调味料、香料及药物中。与传统HS-SPME相比,IRD-HS-SPME有着更短的提取时间和更高的提取效率;与无溶剂微波萃取相比,IRD-HS-SPME在用于干燥的中药样品时,无需在萃取前加入羰基铁粉等吸收介质进行预处理;这表明RD-HS-SPME是中药挥发油快速分析的一种良好的替代选择。槐米和槐角分别共有73种和55种挥发性成分得到了鉴定,其中25种化合物为他们两者共有。所得结果可能会对发现槐米和槐角中可能的活性成分,进而对开发利用来自槐树的中药及其临床应用有所帮助。(已投Journal of Agricultural and Food Chemistry,正在审稿中)第五章针对酶处理用于植物性中药胞内成分释放的研究时所需时间较长(几个小时)的问题,研制了一个温度可控的红外辐射系统,以期在一个相对恒定的温度下运用红外辐射加速酶解过程,并通过模型样品蛇床子的酶解对该系统的可行性和性能进行了论证。通过单因素实验评估酶的种类,酶溶液的pH和浓度,酶解时间和温度对酶活性的影响。获得的最优实验条件如下:0.2 mg/mL的果胶酶溶液,pH为6.0,酶解温度35℃,酶解时间为2 mmin。在最优条件下,对蛇床子红外辅助酶解后进行超声辅助提取,所得蛇床子素和欧前胡素的提取率分别为18.11 mg/g和7.27 mg/g,分别比未经酶解处理直接进行超声提取的对照组增加了10.2%和7.9%。采用红外辐射作为能量来源,酶解预处理的效率与传统水浴辅助酶解相比显著提高(p0.05),红外辅助提取所得蛇床子素和欧前胡素的提取率统计学上均显著高于用超声辅助提取所得的提取率(p0.05)。而且更为重要的是,红外辅助酶解的时间由传统水浴辅助酶解的1h大幅缩短到了2 min。这些结果表明,使用红外辐射来加速酶解以增强中草药活性成分的提取是一个非常有吸引力的方法,因具有环境友好,成本低,操作方便,效率高等优点,应当充分用于天然产物的提取中。(本章研究成果已发表在Analytical Methods (2013,5:5669-5676), IF:1.855,第一作者)


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