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DNA甲基化及关联基因突变对苯作业工人遗传损伤的调控

张光辉  
【摘要】:苯(Benzene)是重要的化工原料,广泛应用于工农业生产中。IARC于1982年将苯分类为确定的人类致癌物(1类化学致癌物),其毒性作用主要靶器官为造血系统,表现为外周血各种血细胞计数的下降、再生障碍性贫血、MDS,甚至引起骨髓造血细胞的恶性转化,引发血液系统癌症;苯致白血病在我国8类职业病肿瘤中排在第一位。慢性苯中毒在上报的慢性职业病中占前三位,现今发达国家苯的职业接触阈限值(TLV)为1ppm (3.25mg/m3,美国为0.5 ppm),而我国的职业卫生标准中苯的职业接触限值为PC-TWA为6mg/m3 。最近研究表明在低于(1ppm)的职业接触下,依旧有苯导致造血系统损伤的研究报道,因此有必要探讨苯对职业工人的健康损害,尤其是血液系统和遗传损伤。个体对于苯毒性的易感性差异除受个体年龄、性别、健康和营养状况影响外,更主要的是受到机体环境应答基因的活性包括代谢酶活性差异和DNA修复能力的不同,这些差异可以归因为相关基因的突变,也可能是表观遗传改变导致了机体在遗传物质不变的情况下改变了生命活动,表观遗传学已是现今的研究热点。表观遗传学尤其是DNA甲基化为揭示苯的致癌机制提供了新的思路,研究表明外周血DNA甲基化水平能够作为生物标志并与膀胱癌、胃癌、乳腺癌和结肠癌等恶性肿瘤有关,并有可能成为筛检苯健康危害新的早期生物标志。本文通过研究分析不同行业苯作业工人外周淋巴细胞遗传损伤和DNA整体甲基化、DNA损伤修复基因甲基化水平;并通过DNA甲基化关联基因的突变检测,分析其对DNA甲基化的影响,以期筛选出反应苯接触的生物标志,以期探索环境-基因-DNA甲基化间的关系。本次研究对象包括浙江某制鞋厂的苯作业工人和安徽某汽车制造公司的涂装等车间作业工人。在六个鞋厂中调查了385名工人(男190名,女195名),平均年龄27.3±4.5岁(17~57岁),选取该制鞋厂同一城市的非接苯或无其它毒物的办公室人员220名作为对照;调查该汽车制造公司181名作业工人(男性144名,女性37名),平均年龄27.1±6.3岁(19~50岁),该汽车公司同地区对照26名,同时在上海选取95名教职工作为外对照。在职业健康体检过程中,对外周血象、尿常规和肝、肾功能进行了检测;同时进行了胞质阻滞微核试验(CBMN)的检测,并随机检测了鞋厂50名作业工人的DNA损伤修复能力。采用定点和个体采样相结合的方法检测作业环境中苯的浓度,根据工人的作业时间和地点计算苯的累积接触剂量,进行接触评估。根据外周白细胞计数和遗传损伤,应用基准剂量(BMD)法计算苯作业工人健康效应(血液毒性和遗传毒性)的基准剂量,以期为修订苯的接触限值提供参考依据。应用PCR-RFLP和测序方法对苯接触工人进行DNA-甲基化关联基因和代谢酶基因的多态性进行检测。选择检测了DNA-甲基化关联基因DNMT3A (rs36012910, rs1550117, DNMT3A18 R882)、DNMT3B (rs2424909, rs2424913, rs1569686)、IDH2 (R140/R172)、MGMT(rsl 6906252)和代谢酶基因CYP2E1(rs3813867, rs2031920, rs6413432)、GSTT1/TM1、GSTP1 (rs1695)和mEH (rs 1051740、rs2234922)的17个位点。从两个现场选取140名苯作业工人和48名对照进行DNA甲基化检测。应用高分辨率熔解曲线(High Resolution Melt, HRM)分析外周淋巴细胞LINE1和MGMT、hMLH1基因启动子区的甲基化水平,用MSP分析MGMT、 hMLH1、RAS、P53、P16、GSTP1基因启动子区的甲基化水平。使用基准剂量软件2.2.1(Benchmark Dose Software (BMDS) Version 2.2.1 U.S. EPA)进行基准剂量的计算。分别以白细胞和微核率为效应指标进行计算,设置对照组指标的95%可信区间的下线作为损伤临界值,即当微核率≥4‰时判定个体遗传损伤;当外周白细胞≤4.3×109/L时,判定为白细胞异常。以Quantal-linear模型对白细胞降低进行计算,得到总人群的BMDL10为24.21mg/m3-年,按照工人一生工作40年计算,其基准剂量浓度为0.61 mg/m3。而女性的基准剂量浓度为0.40 mg/m3。以遗传损伤为效应指标得到总人群的BMDL10为7.64 mg/m3-年,其基准剂量浓度为0.19mg/m3,而女性的基准浓度为0.12mg/m3。多因素Poisson回归分析微核影响因素显示,接触组和对照组微核率分别为3.35±1.91‰和1.92±1.44‰,差异具有统计学意义(P0.01),苯累积接触剂量与微核之间存在剂量-反应关系(FR(95%CI):1.005(1.002,1.008), P0.01).由方差分析所得鞋厂接触组的白细胞低于对照组,差异有统计学意义(接触组vs对照组:5.61±1.58 ×109/L vs 6.47±1.40 ×109/L, P0.01),并且呈显著剂量-反应关系。苯接触组DNA修复能力(3AB指数)为0.22,显著低于对照组的0.37,差异具有统计学意义。随着微核率的升高,DNA损伤修复能力(3AB指数)逐渐降低,方差分析显示差异具有统计学意义(P0.05)。HRM分析结果得出对照组LINE1的甲基化率是54.09±5.84%,高于接触组的甲基化率(48.16±8.07)%,差异有统计学意义。而对照组的MGMT甲基化率为4.89±2.14%,低于接触组的甲基化率6.81±2.14%(P0.05)。对照组的hMLHl甲基化率为10.61±4.84%,低于接触组的甲基化率11.94±7.81%,差异具有统计学意义。应用MSP法定性检测P53、P16、GSTP1、hMLH1、MGMT和RAS的甲基化情况,显示GSTP1、hMLHl、MGMT和RAS在对照组中的甲基化率分别为8%、8%、29%和6%,而在接触组中的甲基化率分别为30%、34%、61%和35%,接触组甲基化率显著高于对照组,差异具有统计学意义。DNA甲基化关联基因突变对甲基化的影响表现为:DNMT3A基因R882C位点(R882C vs野生型;45.06±6.97% vs49.35±8.39%,P0.05)和R882H突变(R882H vs野生型;44.044±3.13% vs49.354±8.39%,P0.05)能够导致LINE1甲基化率的降低。rs36012910 (杂合突变型vs野生型;46.37±4.55%vs48.58±8.56%,P=0.266)的杂合和突变型LINEl甲基化率低于野生型,但是没有统计学意义。双体型分析显示DNMT3A基因AGG/GGG型低于野生型,具有统计学意义(P=0.037);MGMT rs36012910位点的杂合型、突变型的MGMT启动子区甲基化均高于野生型,但是其P值在界值附近(杂合突变型vs野生型;7.26±1.56 vs 6.55±2.40%,P=0.079)。DNA甲基化关联基因和代谢酶基因突变对机体效应指标的影响。其结果显示DNMT3A的rs36012910(野生型vs杂合型:5.66±1.79×109vs 6.34±2.51×109,P0.01)的杂合型导致了白细胞的升高。DNMT3B的rs2424913的杂合型白细胞计数显著高于野生型(野生型vs杂合型:5.75±1.63×109/L vs 6.78±3.17×109/L,P0.05),差异有统计学意义。DNMT3A的R882位点的突变基因型的微核率显著高于野生型(FR(95%CI); 1.14(1.02,1.29), P=0.024),差异有统计学意义。CYP2E1的rs3813867(野生型vs突变型:5.74±1.69×109/L vs5.34±1.29×109/L, P0.05)和rs2031920(野生型vs突变型:5.75±1.63 ×109/L vs5.32±1.43109/L, P0.05)的突变型和杂合型均导致了白细胞的降低,和微核率的升高(rs3813867, FR(95%CI):1.15 (1.02,1.29), P0.05), (rs2031920, FR(95%CI): 1.23(1.09,1.37).本次对35名作业工人随访可见,2009年苯接触浓度远远高于2013年,并且该企业从2009年逐渐改进工艺,引进先进设备,更换无苯涂料,2013年未检测到苯的存在。2013年白细胞计数显著高于2009(2013年vs 2009年:5.39±2.75×107L vs4.62±1.44 × 109/L; P0.01)年,差异具有统计学意义;2009年白细胞计数异常率为71%,2013年异常率为为40%,卡方检验差异具有统计学意义。同样红细胞(2013年vs 2009年:5.22±0.37 × 1O12/L vs 4.04±0.41 × 1012/L; P0.01)和血红蛋白(2013年vs 2009年:151.43±12.12 g/L vs 135.94±14.53 g/L;P0.01)也显著高于2009年。但是2013年微核率略高于2009年(2013年vs 2009年:3.51±1.88‰ vs 2.86±2.07‰),尽管差异没有统计学意义。2009年微核异常率为26%,2013年异常率为51%,但是差异不具备统计学意义。2013年的LINE1基因的甲基化率高于2009年,具有显著统计学差异(2013年vs 2009年:51.31±7.63%vs 45.10±9.95%:P0.01)。而hMLHl基因启动子区甲基化率低于2009年,差异在统计学界值上(2013年vs 2009年:11.45±5.53%vs9.28±4.32%;P=0.081)。说明在随着接触浓度的降低,接触工人的外周血象,包括白细胞、红细胞和血红蛋白在逐渐升高,但是其微核率代表的遗传损伤依然在加重,其外周血总甲基化率(LINE1)也在升高,DNA损伤修复基因的hMLH1基因启动子区甲基化水平降低。综上所述,在我国现行职业卫生标准下,苯仍可造成遗传物质产生损伤和造血毒性;苯接触可以导致机体整体甲基化率(LINE1)的降低,也可导致环境应答基因(GSTP1、hMLH1、MGMT和RAS)的启动子区甲基化水平的升高。而甲基化关联基因突变可能调控着机体的甲基化水平,DNMT3A/3B的R882突变可以导致LINEl甲基化率的降低,并且突变位点组的外周白细胞计数低于野生型,而微核率高于野生型,具有一定关联。研究发现DNMT3A/3B的两个位点的突变(rs36012910和rs2424913)是机体的保护因素,但是其LINE1的甲基化率是降低的,没有发现直接联系。DNA甲基化关联基因突变对甲基化的调控和机体健康的影响还需要进一步扩大样本量和甲基化位点数的检测,进一步研究其调控机制。随访观察发现当苯作业工人由很高浓度转到低浓度(6mg/m3)环境中,外周血血象逐渐恢复升高,并且其DNA甲基化水平也向着正常恢复,但是其遗传损伤仍然存在,甚至会进一步加重。


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