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三氧化二砷抑制GLI1表达诱导肝癌干细胞分化延长术后生存期的实验研究

张克志  
【摘要】:研究背景肝细胞癌(简称肝癌)位于全球男性常见肿瘤发病率的第五位,死亡原因的第二位,在女性当中,位于常见肿瘤发病率的第七位及死亡原因的第六位。目前,手术治疗仍是肝癌的首选治疗方法,但因为缺少有效的辅助治疗使肝癌的术后复发率仍然较高,长期预后仍不满意。肝癌干细胞在肝癌术后复发中起着关键作用。CD133+肝癌细胞因较强的成瘤能力,自我更新及对放疗的抵抗性而被认为具有肝癌干细胞的特性。干细胞的诱导分化治疗可以使干细胞向非干细胞分化,失去其自我更新能力从而可以使其恶性潜能得到控制。三氧化二砷可以诱导急性早幼粒细胞白血病细胞分化及凋亡使患者缓解率大幅上升,生存期明显延长。在本研究中,我们假设三氧化二砷是否可以诱导肝癌干细胞分化,抑制术后复发及延长生存期,并探索其作用机制。方法本研究设计如下:1、体外试验选用人肝癌细胞株Huh7及Hep3B,利用流式细胞仪技术筛选出CD133+的Huh7及Hep3B细胞,阳性率超过90%进行体外试验。我们研究了三氧化二砷对其干预后,利用RT-PCR技术观察了CD 133 mRNA的变化、利用Western blotting及免疫荧光技术观察了CD133蛋白的改变、利用流式细胞仪技术观察了CD133+细胞的比例变化、利用体外成球试验观察了肝癌干细胞的自我更新能力的改变、利用NOD/SCID小鼠皮下成瘤观察了其体内成瘤能力的改变、利用基因芯片观察了其干性基因的变化、利用CCK8观察了三氧化二砷对其增殖的影响。2、体内试验裸鼠原位接种Huh7/Huh7-GFP(荧光蛋白稳转细胞株)及Hep3B/Hep3B-GFP(荧光蛋白稳转细胞株)细胞,2周后行根治性切除,切除后给予每天1.5mg/kg三氧化二砷腹腔注射治疗,观察了裸鼠的复发及生存期,并观察三氧化二砷对循环血肿瘤细胞(CTCs)的影响。3、机制探索我们进一步利用基因芯片技术探索了三氧化二砷诱导肝癌干细胞分化的调控机制,并构建慢病毒干扰/过表达目的基因的稳定细胞株,进行验证。结果三氧化二砷体外可以诱导CD133+肝癌干细胞分化,表现为下调CD133mRNA、蛋白的表达及干性基因的表达,并且能够抑制干细胞的自我更新能力及成瘤能力,并且不抑制其增殖。在体内试验中,三氧化二砷可以使裸鼠的术后复发率明显下降:Huh7-GFP细胞株复发率由75%下降为33.33%(P=0.0405),Hep3B-GFP细胞株由91.67%下降为41.67%(P=0.0094);生存期明显延长:Huh7细胞株中位生存时间由72.5天延长至86.5天(P=0.0344),Hep3B细胞株由89.5天延长至104天(P=0.015);三氧化二砷能够明显降低循环血肿瘤细胞:Huh7-GFP细胞株循环血肿瘤与全血单核细胞(PBMC)的比例由1.758%下降至1.292%(P=0.0305), Hep3B-GFP细胞株由1.235%下降至0.619%(P0.0001),体内试验同时表明三氧化二砷对实验动物没有明显的毒副作用。三氧化二砷可以明显抑制Hedgehog-GLI通路中GLI1及其下游基因的表达,通过构建GLI1过表达和干扰的细胞稳定株,发现CD133相应的发生过表达或抑制,同时三氧化二砷并不能明显降低GLI1干扰细胞CD133表达。结论:1、三氧化二砷可以诱导肝癌干细胞分化;2、三氧化二砷可以抑制肝癌术后复发,延长生存期,并能降低循环血肿瘤细胞;3、三氧化二砷诱导肝癌干细胞分化的作用机制可能在于抑制GLI1的表达。应用价值1、细胞实验及动物实验提示三氧化二砷可以诱导肝癌干细胞分化,抑制术后复发,延长生存期,为临床应用提供充足的实验基础;2、三氧化二砷可以通过抑制GLI1的表达达到诱导肝癌干细胞分化,抑制复发,延长生存期的作用,为临床挑选适合三氧化二砷治疗的病人提供理论基础。创新点1、首先提出三氧化二砷可以诱导肝癌干细胞分化;2、发现三氧化二砷诱导肝癌干细胞分化的机制可能在于抑制Hedgehog-GLI通路中GLI1表达;3、发现三氧化二砷抑制肝癌术后复发,延长生存期,并试图从干细胞学说解说其机制,为临床应用提供理论依据。


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