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甲基强的松龙和神经干细胞移植修复脊髓损伤的实验研究

李立新  
【摘要】: 脊髓等中枢神经的各种损伤均会导致神经元的变性、坏死,由于局部缺乏合适的微环境,使得损伤的神经元无法再生、修复而留下截瘫等严重后遗症,给社会和家庭带来了沉重的负担。脊髓损伤后其神经功能的障碍主要由原发性损伤和继发性损伤所引起。原发性损伤是指脊髓直接的机械性损伤,如挫伤,裂伤等,损伤的程度与损伤当时的伴随情况(如扭转、旋转、伸展)密切相关;随后损伤部位的出血、水肿引起脊髓组织的继发性损伤,随时间的变化可使得脊髓的功能进一步恶化。在此过程中常伴有以中性粒细胞、单核细胞浸润为主的伤后炎症反应,一方面这些浸润的炎性细胞清除崩解的髓鞘碎屑,分泌一些糖蛋白及生长因子,有利于损伤的修复;另一方面,这些激活的炎性细胞释放出蛋白水解酶、超氧化物酶,产生大量的自由基,导致脂质过氧化而损伤血管壁,血管壁通透性的增加则加重局部组织的出血、水肿,导致脊髓组织的进一步损伤。目前,脊髓损伤的治疗重点已延伸到了继发性损伤和慢性损伤阶段。 糖皮质激素具有抗炎、抗氧化,清除自由基、稳定溶酶体膜、抑制血管源性水肿、增加脊髓组织血供等作用而常用来控制脊髓伤后的炎症反应和继发性损伤。在众多的糖皮质激素中如可的松,氢化可松、强的松、强的松龙、甲基强的松龙、去炎松、地塞米松、倍他米松等,甲基强的松龙因起效快、作用强、盐皮质激素作用弱、对肾上腺一垂体轴负反馈抑制作用轻、停药后副作用少而成为治疗急性脊髓损伤的首选用药。实验及临床试验的结果表明,早期大剂量使甲基强的松龙能显著控制脊髓的伤后炎症反应并改善预后。但甲基强的松龙本身不产生新的神经元,所以脊髓损伤后仅使用甲基强的松龙治疗其神经功能的恢复并不理想。 九十年代中期以来许多研究发现,成人脑的有些区域可以产生新的神经元,进一步研究证实,这些新的神经元来自脑的神经干细胞。在哺乳类胎儿,神经干细胞集中在嗅球、侧脑室的脑室区、室下区、海马、脊髓、后脑和脑皮层。神经干细胞是长期具有自我更新能力的细胞,在合适的条件下可被分离、纯化。若被移植回中枢神经系统,它能进一步迁移、分化,与宿主神经元整合并发挥神经功能。这完全改变了中枢神经系统损伤后神经元无法再生修复的传统观念,使得神经干细胞移植治疗脊髓等中枢神经的损伤成为当今神经科学的一个热点。目前,神经干细胞移植后促进何种神经元和髓鞘再生,其作用机制缺乏深入的研究和定量评价。 至目前为主,还没有一种方法单独使用能完全治愈脊髓损伤,急性脊髓损伤仍是一种致残的危害人民健康的严重疾患,未来的治疗可能需采用策略性的联合治疗方法。有些研究采用综合治疗的方法,但它们都偏重于减轻伤后炎症反应或促进神 WP=6 经轴索及髓鞘再生而不是同时影响两者。因此,本研究选择既控制炎症又促进神经轴索及髓鞘再生的联合治疗方案,制备鼠T10脊髓损伤模型,体外培养、诱导鼠神经干细胞,从基因表达、形态结构及神经功能等三个方面来评价甲基强的松龙和神经干细胞移植联合治疗对鼠脊髓损伤后神经、髓鞘结构修复和功能恢复的作用并探讨其作用机制, 旨在探讨一种有效的联合治疗方案,为甲基强的松龙和神经干细胞移植联合治疗脊髓损伤的临应用提供实验依据。 第一部分 甲基强的松龙和神经干细胞移植对脊髓神经元再生的影响 制备鼠T10脊髓损伤模型,脊髓损伤后立即静脉推注甲基强的松龙或生理盐水。体外培养、诱导鼠神经干细胞并移植于脊髓损伤区,以ED-1(单核-巨噬细胞的识别标志)、神经微丝(Neurofilament, NF)、生长相关蛋白(Growth associated protein, GAP-43)及其信使核糖核酸(GAP-43 mRNA)、胆碱乙酰转移酶(Choline acetyl transferase, ChAT)、降钙素基因相关肽(Calcitonin gene related peptide, CGRP)等作为观察指标,定量评价甲基强的松龙(methylprednisolone, MP)和神经干细胞(neural stem cells, NSCs)移植联合治疗对鼠脊髓损伤后神经元再生修复的作用并探讨其作用机制。结果显示: 1.与生理盐水加细胞培养液 (NS+CCM)的对照组(15277±12, n=10)相比,甲基强的松龙加细胞培养液(MP+CCM)的治疗组(2680±11, n=10)和甲基强的松龙加神经干细胞移植的治疗组(MP+NSCs) (2692±11, n=10)脊髓损伤区ED-1阳性的炎性细胞明显减少(P0.05)。2. 实验后1d,MP+NSCs的治疗组中GAP-43 mRNA的表达较NS+CCM的对照组和MP+CCM的治疗组分别增加了48.6%、48.3%(P0.05,n=3);实验后3d,MP+NSCs治疗组GAP-43 mRNA的表达至高峰, 分别较上述两组增加了58.6%、57.8%(P0.05,n=3);实验后7d,NS+CCM对照组和MP+CCM治疗组中GAP-43 mRNA的表达降至正常,MP+NSCs的治疗组GAP-43 mRNA的表达开始下降,但仍维持较高的水平。3.实验后10周,NS+CCM和MP+CCM 两组中NF阳性的神经纤维(2568±11,2582±11,n=10)较少, GAP-43阳性的再生神经纤维(443±10,456±11, n=10)数量和ChAT阳性的运动神经纤维(318±7,323±8, n=10)亦较少;MP+NSCs治疗组中可见大量NF阳性的神经纤维(5278±12, n=10)及GAP-43阳性的再生神经纤维(1632±10, n=10),且再生的神经纤维以ChAT阳性的运


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