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肝细胞癌转移预测模型的建立及其转移相关基因的筛选——cDNA微阵列技术分析

叶青海  
【摘要】: 肝细胞癌(简称肝癌)是世界上最常见、恶性程度最高的肿瘤之一,位居全球恶性肿瘤发病率的第5位、死因的第4位,在我国更是已经成为恶性肿瘤第2位的死因。虽经几十年不懈努力,肝癌临床研究取得了许多重大进展,部分肝癌病人因早期、积极治疗而获得长期生存,但大部分病人诊断时已属晚期,预后很差,总5年生存率低于5%。其高死亡率的主要原因之一是肝内转移的发生。而迄今对肝癌肝内转移的分子机理知之甚少,也缺乏特异有效的治疗手段。 为此,本课题采用目前国际上最先进的分子生物学及遗传学技术――cDNA微阵列(基因芯片)技术在全基因组范围内比较40例不伴与伴有肝内转移(管道癌栓或肝内播散)的肝癌之间、肝癌肝内转移灶与原发瘤之间基因表达谱的差异,寻找与肝癌转移相关的基因,探索肝癌转移的分子机制。40例标本中27例伴有肝内转移,每例包括肝癌原发瘤、肝内转移灶(12例管道癌栓,15例肝内播散灶)及相邻无瘤肝组织;13例不伴转移,每例仅有原发瘤及相邻无瘤肝组织。本研究所用cDNA微阵列芯片由美国国立卫生研究院癌症研究所(NCI)技术开发中心制作,每张芯片有9984个点,含9180个基因。其中7102个为已知基因(包括大部分目前已知与肿瘤相关的基因),1179个为表达序列标签(EST)。微阵列实验采用双色荧光直接标记法,每例病人的无瘤肝组织总RNA 100(g用红色荧光素Cy3标记,其相应肝癌原发瘤或肝内转移灶组织总RNA200(g用绿色荧光素Cy5标记,经逆转录反应并混合后同时与微阵列芯片上的探针进行杂交。用GenePix 4000扫描仪进行扫描,得到基因表达情况的图像资料,再经GenePix Pro 3.0电子计算机图像处理软件转换成原始数据,将原始数据均衡化以后用专业数据处理软件进行进一步处理,得出样本中基因表达情况的详细资料,再进行基因表达谱分析。40例中的18例行两次独立的微阵列杂交实验。 采用美国国立癌症研究所开发的BRB-阵列软件包中先导的(即事先提供标本的临床分类信息)计算机分析方法“分类比较法”(Class Comparison Tool),采用单变量F检验和2000次随机置换检验,以相邻无瘤肝组织作对照,比较伴有肝内转移的肝癌与不伴转移的肝癌的基因表达谱,结果发现伴有转移的肝癌与不伴转移的肝癌之间基因表达谱差异明显,在p0.001水平,在9180个基因中153个基因表达差异有显著性;而肝癌原发瘤与肝内转移灶之间基因表达谱非常相似,仅5个基因表达有差异,且差异没有显著性(p=0.132)。提示与肝癌转 WP=5 移相关的基因改变大部分在原发瘤阶段就已经发生。然后,采用BRB-阵列分析软件中另一种先导的分析方法“混合共变预测法”(Compound Covariate Predictor Tool,CCP),利用伴和不伴肝内转移的肝癌之间153个有显著性差异的基因,我们在国际上首次利用肿瘤的基因表型建立了一个肝癌转移的预测模型,能在原发瘤阶段就预测肝癌是否具有转移倾向。这一预测模型除将建立模型的20例标本完全正确(100%)归类外,还准确预测了20例待测标本中的至少18例,预测准确率达90%以上。为减少因显著水平太高(p0.001)而引起的假阴性结果,我们再次采用BRB-阵列分析软件中的分类比较法,在p0.002水平寻找伴与不伴肝内转移的肝癌之间表达有差异的基因,结果发现了224个基因表达有显著性差异,从中筛选出36个在两组间表达差异更加明显的基因。发现其中一个基因骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)在伴肝内转移的肝癌中高表达(超过无瘤肝组织3倍),而在无转移肝癌中变化不明显。然后,进一步利用几个具有不同转移潜能的肝癌细胞系对其进行了功能鉴定,体外细胞侵袭实验发现抗骨桥蛋白中和抗体能显著抑制肝癌高转移细胞如SK-Hep-1及MHCC97等的侵袭能力,证实骨桥蛋白为一与肝癌转移密切相关的基因。半定量RT-PCR和免疫组织化学实验也进一步证实了骨桥蛋白在伴有肝内转移的肝癌组织中的高表达。而且骨桥蛋白为分泌性蛋白,可在血清中检测。提示骨桥蛋白可能成为肝癌转移预测、诊断的良好指标及治疗的靶基因。


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