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有关乳酸菌质粒和表达体系的研究

王荫榆  
【摘要】: 大部分乳酸菌是普遍认为安全的益生菌,利用一些乳酸菌可以在胃肠道、泌尿、生殖系统中或粘膜部位粘附存活且无病原性等特点,开展乳酸菌作为活菌口服疫苗或粘膜疫苗载体的研究受到了广泛的重视。乳酸菌活菌携带抗原可以诱导免疫反应已经在不同的实验室得到了证明。与乳酸乳球菌相比,乳酸杆菌特有的一些性质使其成为口服疫苗更好的选择,这些特性包括它们的免疫原性,对上消化道内情况的耐受以及能在胃肠道中长时间留存,然而乳球菌在选择抗原诱导免疫反应方面更加有效,但是乳杆菌的阳性结果十分有限。这种不同的原因目前仍然不清楚,可能与抗原在乳杆菌中低水平表达有关。这暗示筛选不同的乳酸菌菌株作为口服疫苗载体和匹配不同的表达载体的必要性。 从乳酸菌保健晶中分离筛选到两株可以作为受体菌株的乳酸菌,一株球菌和一株杆菌。经过16SRNA全长序列分析及配合生理生化实验鉴定,结果显示球菌为肠球菌属中的粪肠球菌(Enterococcus faecalis),杆菌为乳酸杆菌属中的植物乳杆菌(Lactobacillu plantarum),是两株胃肠道内正常定植菌。抗药性实验显示粪肠球菌对多数药物敏感或中度敏感,对万古霉素抗性水平也为中度敏感。植物乳杆菌中本身存在一大一小两种质粒,粪肠球菌中没有质粒存在。利用不同的电压进行脉冲转化两株乳酸菌,发现两株菌的转化效率和电压有对应的正相关,并且粪肠球菌的转化效率明显比植物乳杆菌高。这些结果显示两株菌在乳酸菌基因工程研究中可以有不同的用途。 从屎肠球菌df101菌株中分离到隐秘的小质粒pEFR,全序列分析显示质粒pEFR由3176bp组成,编码四个推定的ORF,ORF1编码的一个推定的蛋白和复制有关的repA有很高的相似性。在ORF1上游具有典型的-10区、-35区和RBS碱基序列,-35区上游附近四段22bp正向串联重复序列,相类似的序列也见于质粒pMBB1、pVS40、pLQ510复制蛋白酶基因上游。Southern blot显示pEFR属于θ复制机制类型的质粒。通过缺失和插入实验确定了质粒pEFR具有复制功能的DNA 工前榆.有关乳酸菌质粒和表达体系的研叽 搏I:论义,2003 tpotaH4.Ieq:tMtatoZb,、T:n:_;$Mdriat;+dej+_lllV。VO、4O_OV,1。ltolbdri 一 斤成,付利用极好汉们没1M幻0仍穿w衣地软件pw!Ow/洲pOI 114no 例烃们 表达载体在我们分离到的受体菌EfQecalis和L.plantarum中能够表达绿色荧光蛋 白OPPX表达的水平依赖于一定范围浓度的 N i St n诱导。正在利用这一表达体 系研究乙肝表面抗原和核心抗原的在乳酸菌中表达及口服免疫。 分离的受体菌植物乳杆菌中含有两种质粒。通过药物、温度等对两种质粒进 行消除实验,结果显示两个质粒在原宿主菌相当稳定。分离两个质粒并进行全序 丛 列测序分析发现,司质粒pLP2000由2062 fop组成,编码一个推定的37kd的复 t”“””“‘“””’”’一”“”””””’一”“—一’—--”『一‘一’”’—”’”—”——”-——”一 制蛋白酶,复制蛋白酶基因下游具有多段 17hp串联的正向重复序列。质粒 pLP9000由9253hp 组成,编码9个ORF。其中ORFI 编码一个推定的镁离子向内 跨膜蛋白,ORFZ编码一个推定的噬菌体整合酶蛋白,没有发现编码和复制相关 的复制蛋白酶阅读框。Southern blot显示 pLP2000和 PLP9000两种质粒属于滚环 复制类型质粒,和滚环复制相关的钻 序列可能形成的二级结构分别为SSO和 SSOU类型。并且这两种质粒和 pGK!2、PNZ9530等质粒具有相容性。 。为进一步研究植物乳杆菌中两个质粒的关系,搜集了17株属于不同株的植 可”—””’““’“—”“”‘’”’『”‘。—,—““。“。”’。。—。。·’·。、,—。’··。…、。。·一 物乳杆菌,这些株植物乳杆菌并没有不含有质粒的,并且每个菌株至少有两种质 粒。对17株植物乳杆菌中的小质粒进行分离测序分析,它们编码复制蛋白酶基 因的核苦酸序列完全相同。并且在复制酶基因3末端均有17hP的正向串联重复 序列,但重复次数有很大差异,可分为8种不同的重复类型。重复序列具有链内 高度互补配对的能力,能形成稳定的茎环结构。具有不同的重复序列的小质粒的 各菌株间的 16SRNA序列上的差异没有对应关系。利用实时定量 PCR方法检测了 各小质粒在原宿主菌中的拷贝数,结果各质粒在原宿主菌中有不同的拷贝数。不 同的重复序列对质粒拷贝数的影响实验正在进行中。


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