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3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶AroG的结构与功能的研究

胡昌云  
【摘要】: 在细菌和植物中,由公共途径莽草酸途径以及三个专一性途径分别合成苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸三种芳香族氨基酸。公共途径第一步反应是公认的限速步骤,由DAHP合成酶的三种同工酶催化。在大肠杆菌中,aroG基因编码受苯丙氨酸反馈抑制的DAHP合成酶同工酶AroG,催化E4P和PEP反应生成DAHP。本博士论文工作以大肠杆菌K-12来源的AroG为研究对象,通过定点突变、反馈抑制实验和酶学动力学参数的测定,深入地研究了AroG的反馈抑制位点的特性,并对AroG的N-末端在反馈抑制机理和维持稳定四级结构中的作用,以及蛋白质结构的“D2”对称性对酶功能的重要性等进行了具体的研究。 第一部分工作通过氨基酸突变研究确证了从AroG蛋白质晶体结构推测的参与构成反馈抑制位点的各个氨基酸。实验结果表明:在1 mM苯丙氨酸的存在下,1)野生型AroG受到90%以上的反馈抑制;2)Pro150Leu,Leu179Ala,Phe209Ala和Val221Ala这四种点突变在保持与野生型AroG相近的比活的同时,解除了80~100%的反馈抑制;3)点突变Phe144Ala仅解除反馈抑制约30%,同时保持与野生型相当的比活;4)突变体Leu175Ala仅能够解除18%的反馈抑制,Leul75Gln能够解除44%的反馈抑制,Leu175Asp解除了84%的反馈抑制,并且比活都比野生型高。综合前人的研究和本研究工作的实验数据,得出以下结论:1)在AroG的反馈抑制位点供苯丙氨酸结合的疏水口袋由Asp6、Asp7、Ile10、Ile13、Pro150、Gln151、Leu175、Leu179、Ser180、Phe209、Ser211和Val221等12个氨基酸残基构成;2)苯丙氨酸结合的疏水口袋分为两个区域,与苯丙氨酸的苯环发生疏水作用的区域由Ile10、Ile13、Pro150、Leu175、Leu179、Phe209和Val221的侧链构成,而Asp6、Asp7、Gln151和Ser180的侧链构成了与苯丙氨酸的氨基和羧基相互作用的区域。 第二部分工作研究了AorG的N-末端的功能。对N-末端的点突变和缺失突变的研究结果表明:1)在1 mM苯丙氨酸的存在下,点突变I10A和缺失突变△(1-15)能够完全解除反馈抑制,但它们的比活明显降低,Ile10Ala降低了65%,△(1-15)降低90%以上;2)在1 mM苯丙氨酸的存在下,点突变Asn5Lys对仅解除反馈抑制40%,而它的比活与野生型相接近;3)Superose 6凝胶过滤 博士论文:3一脱氧一D一阿拉伯庚酮糖一磷酸合成酶AroG的结构与功能的研究 层析和W七stem Blot结果均表明野生型户曲G的存在形式有单体、二聚体和四聚 体三种,N一末端巧个氨基酸残基的缺失突变体仅以单体的形式存在。这些结果 揭示:1)N一末端在反馈抑制机理中具有重要作用;2)N一末端的缺失使得Ar0G 紧密二聚体结构解聚,导致四级结构破坏。N一末端是形成紧密二聚体的必需结 构元件。 第三部分工作研究了户四G结构上的“DZ”对称性在反馈抑制中的作用。 对“DZ”对称性相关的氨基酸Leul6、TrpZ15和HisZ17进行点突变和双突变研 究结果表明:l)在1 mM苯丙氨酸的存在下,Leul6Ala、TrpZ15Ala和HisZ17Ala 能解除35一70%的反馈抑制,T印2巧Ala的比活降低65%以上,其余两者的比 活与野生型相近;2)在lmM苯丙氨酸的存在下,导入双点突变 TrpZ 1 SAI洲isZ17Ala和Leul6Hi撇isZ17Leu后能够完全解除AroG的反馈抑制, 同时保持与野生型相当的比活。这些结果说明“DZ”对称性相关氨基酸残基的 点突变和双突变导致了对称性的变化,影响了反馈抑制信号的传递,因此能够 部分或完全解除户曲G的反馈抑制。“DZ”对称性结构是AioG正常反馈抑制功 能的必要结构形式。 本研究工作通过以上三个方面对户曲G的反馈抑制机理有了比较深入而系 统的了解,明确了户JOG的结构与功能的关系。为芳香族氨基酸合成途径的反 馈调控的解除提供了理论基础,对芳香族氨基酸发酵工业的发展具有指导意义。


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