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人低分子量双特异性磷酸酶基因LMW-DSP2、LMW-DSP3的克隆与功能研究

程海鹏  
【摘要】: 双特异性磷酸酶能够使磷酸化的酪氨酸残基和丝/苏氨酸残基去磷酸化,在有丝分裂、信号传导、胞外刺激和细胞周期等通路中发挥重要作用。 通过大规模人类cDNA测序,我们从胎脑cDNA文库中克隆了两条低分子量的双特异性磷酸酶基因。我们对两条双特异性磷酸酶基因进行了生物信息学分析和功能研究。其中LMW-DSP2的cDNA具有1037个碱基,拟编码的蛋白具有184个氨基酸,具有一个双特异性磷酸酶的催化结构域。蛋白产物的分子量为20.9 kDa,等电点为8.09。LMW-DSP2与小鼠中的同源蛋白具有96.7%的同源度。LMW-DSP2基因定位于6p22,该区段的染色体异常与多种白血病、间皮瘤、腺癌、淋巴瘤,骨髓瘤有关。LMW-DSP2基因具有8个外显子和7个内含子,所有外显子与内含子的接头都符合AG-GT规则,在染色体上跨度58kb。LMW-DSP2同源的EST,它们分布于胎盘、肺、脑、胰腺、肠、睾丸、骨髓、皮肤、子宫、乳房等组织。Northern Blot结果显示LMW-DSP2在心脏,骨骼肌和胰脏中有表达,检测到1.8kb,2.0kb,4.0kb三个转录本。4.0 kb在心脏,骨骼肌和胰脏均有表达;1.8 kb在心脏和胰脏中表达;而2.0 kb仅在骨骼肌中表达。SAGE结果表明LMW-DSP2基因在肿瘤细胞和组织中广泛表达。GST-LMW-DSP2融合蛋白具有对pNPP的磷酸酶活性,其最适pH值是7.0,最适温度是37℃,磷酸酶抑制剂钒酸钠能够完全抑制LMW-DSP2的磷酸酶活性。Cys88和Asp57高度保守,任一位点的突变都会使磷酸酶活性急剧下降。LMW-DSP2蛋白能够使磷酸化的酪氨酸残基和丝/苏氨酸残基去磷酸,表明其是一个双特异性磷酸酶。通过酵母双杂交筛选人类胎脑文库,发现LMW-DSP2蛋白与参加囊泡运输的RAB11A具有相互作用。LMW-DSP2蛋白在细胞质和细胞核中均有分布,对JNK的磷酸化具有促进作用。 LMW-DSP3基因cDNA具有1444个碱基,拟编码的蛋白具有217个氨基酸。该蛋白具有双特异性磷酸酶的催化结构域,但没有CDC25同源结构域,是一个低分子量的双特异性磷酸酶。蛋白分子量是24.2kDa,等电点是6.36,与小鼠LMW-DSP3具有84%的同源度。LMW-DSP3基因定位于2q32,该区域与骨髓瘤,贫血症,淋巴瘤,白血病等疾病相关。LMW-DSP3具有5个外显子和4个内含子,在染色体上跨度21kb。Northern Blot结果没有特异条带,RT-PCR结果显示LMW-DSP3在心、肺、肝和胰腺中有表达,其中在胰腺的表达量最高。LMW-DSP3在L0-2正常肝细胞和SMMC-7721肝癌细胞中有表达,而在肝癌 WP=5 细胞BEL-7402和QGY-7701中没有表达。6His-LMW-DSP3的表达产物形成包涵体,未能获得可溶蛋白。GST-LMW-DSP3融合蛋白具有对pNPP的磷酸酶活性,其最适pH值是7.0,最适温度是37℃,LMW-DSP3的磷酸酶活性不依赖于二价阳离子,Ca2+和Mn2+对磷酸酶活性具有轻微的促进作用。钒酸纳能够完全抑制LMW-DSP3的磷酸酶活性。通过酵母双杂交筛选人类胎脑文库,发现LMW-DSP3蛋白与一个具有TB2-DP1-HVA22结构域的蛋白具有相互作用。LMW-DSP3蛋白定位于细胞质中。Cys150和Asp119高度保守,突变都会导致磷酸酶活性急剧下降。LMW-DSP3蛋白能够使磷酸化的酪氨酸残基和丝/苏氨酸残基去磷酸,表明其是一个双特异性磷酸酶。在293细胞中,LMW-DSP3蛋白能够抑制JNK的活性,说明它是一个新的MAPK磷酸酶。


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