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内源性bFGF在缺血性脑组织中的表达和调控及外源性bFGF的应用时间窗口和信号转导机制

刘颖  
【摘要】: 目的:碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF) 在中枢神经系统发育过程中起到促进增生、分化的重要作用,可促进各类神经移植物的存活和/或功能发挥。此外,bFGF还保护神经元免受各种损伤因素及兴奋性氨基酸的损伤。已有大量文献报道了应用外源性bFGF可以减少缺血缺氧造成的实验动物脑梗死面积或促进梗死损伤后神经功能的恢复。上述实验均从梗死面积的测定以及动物整体行为功能测定方面描述了外源性bFGF的重要作用。bFGF作为脑内含量最高的一类生长因子其含量可以达到40~50(g/Kg。在中枢神经系统中多种细胞可以表达bFGF,但其主要来源于星形胶质细胞(Astrocytes, As)。在脑组织受到各种损伤的情况下As可以活化分泌bFGF增加。缺血性损伤后内源性bFGF的表达有无变化?为什么缺血损伤后内源性的bFGF不能有效发挥神经保护作用?外源性bFGF进入脑内对内源性bFGF表达有无影响?均尚未有实验探究。我们试图在明确缺血损伤后内源性bFGF在脑内各种细胞中的动态表达及其与自身受体表达的相互关系的基础上,为阐明外源性bFGF应用缺血性损伤治疗的原因及机制提供实验依据。 Egr-1(egrly growth response protein 1)能够与bFGF基因启动子结合促进其转录活性。NAB2(NGFI-A binding protein 2)蛋白被认为是Egr-1的特异性抑制因子。脑缺血缺氧损伤后是否有Egr-1蛋白及NAB2参与bFGF的表达未见报导。bFGF作为硫酸肝素类结合分子,有双重受体系统:细胞外基质中硫酸肝素蛋白多糖的低亲和力受体及多种细胞膜表面上的高亲和力受体。bFGF与高亲和受体结合后启动了多种信号转导过程,其中MAPK信号转导通路最值得关注, bFGF的表达转录因子Egr-1也受到MAPK信号通路的调控。外源性bFGF作用于缺血损伤细胞的信号转导机制及对自身表达的影响尚未见研究报告。 缺血损伤后血脑屏障受损乃至通透性改变的报道各家不一,对bFGF的通透性更无专门的报告。因而早期应用外源性bFGF治疗缺血性损伤就具有了一定的盲目性。 本课题试图通过阐明缺血损伤对内源性bFGF及受体表达的影响;外源性bFGF对缺血缺氧细胞的保护机制及对内源性bFGF表达的影响以及脑缺血损伤后外源性bFGF用药窗口等问题为bFGF应用临床治疗脑缺血提供实验与理论依据。 WP=6 方法:采用大鼠持续性大脑中动脉栓塞模型(permantent middle cerebral artery occlusion, pMCAO),应用免疫组化,western-blot, RT-PCR等方法系统观察了大鼠脑持续性局灶性缺血损伤后自0.5h起到14d神经元和As等细胞表达Egr-1、bFGF蛋白及bFGF特异性的高亲和力受体bFGFR的动态变化。 用体外原代培养的As的缺血缺氧模型,采用western-blot、免疫荧光双标记的方法观察了Egr-1、NAB2蛋白表达的动态变化并采用凝胶电泳迁移率变动分析(EMSA)分析了Egr-1与bFGF启动子结合能力的动态变化。 在体外原代培养的As的缺氧-给氧损伤后,采用western-blot检测了体外缺氧-给氧损伤后外源性bFGF对MAPK信号转导通路中raf-MEK-ERK中MEK-1、ERK-1/2蛋白表达水平、ERK磷酸化水平及SAPK/JNK 通路中JNK磷酸化程度影响。并采用EMSA分别检测分析了缺氧-给氧损伤、缺氧-给氧损伤并给予bFGF对Egr-1蛋白活性的影响,以明确在缺氧损伤后外源性bFGF对内源性bFGF表达的影响,并在给予bFGF后加入MEK的特异性抑制剂U0126 后检测Egr-1的活性,分析了其与信号转导通路的关系。 采用抗BBB抗体免疫组化方法显示了pMCAO 后不同时段BBB结构的改变。采用125I标记bFGF 的放射标记示踪的方法对pMCAO后静脉应用bFGF通透血脑屏障的时间窗口进行了探讨。 结果: 体内 实验发现在pMCAO损伤后,应用半定量RT-PCR显示在缺血梗死损伤后0.5h bFGFmRNA就开始增加,持续到损伤后1天(p0.05),免疫组化见缺血 bFGF表达出现双相增强,分别是缺血1h及缺血后6h~1d时缺血边缘区bFGF染色增强,主要见于As,表现为胞浆、胞突及细胞核阳性增强,神经元细胞核反应亦增强,但始终弱于As。与免疫组化不同的是western-blot显示仅在缺血后12h~2d时分子量为18kDa bFGF含量明显增加(p0.05), 22 kDa的bFGF仅在缺氧后1d表达增强,24 kDa的bFGF仅在缺氧后2d时表达增强,未见缺血1h有任何分子量bFGF含量的增加。 半定量RT-PCR显示bFGFRmRNA在pMCAO后0.5h开始升高(P0.05),持续到pMCAO后2h,免疫组化检测发现bFGFR在2~6h明显增强。bFGFRmRNA 及蛋白表达均早于bFGFmRNA 和蛋白的表达高峰。 免疫组化及western-blot显示缺血后1h~6h时Egr-1蛋白表达增加。 在体外原代培养的As缺血缺氧模型上测得损伤后0.5~4h Egr-1蛋白表达明显升高(P0.05),6h迅速回落降低到正常水平。与Egr-1蛋白表达规律不同,NAB2在损伤后4h时表达开始增强(P0.05),持续表达到缺氧1d,表达时相晚于Egr-1蛋白的表达。EMSA显示缺血缺氧损伤后As中Egr-1核蛋白与bFGF WP=7 启动子结合活性在4~12h升高。免疫荧光双标记见到在正常情况下Egr-1 蛋白和NAB2蛋白主要存在于As胞浆及核周,胞突明显着色,细胞核内可见微弱的表达。缺血1h后,Egr-1 蛋白在细胞核内的表达开始增强,而NAB2的表达仍然主要在胞浆内。随着时间的延长,缺


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