反义TIMP-1表达质粒对实验性肝纤维化影响的体外研究

【摘要】： 背景：肝纤维化(hepatic fibrosis) 是多种慢性肝病的共同病理基础，是临床向肝硬化发展的必经环节。目前研究认为肝纤维化属于可逆性病变。 肝纤维化过程中以胶原为主的肝脏细胞外基质(ECM，extracellular matrix)合成增加，降解相对不足，过度沉积在肝内。ECM降解减少是肝纤维化形成的主要机制。在ECM 降解过程中起主要作用的是基质金属蛋白酶( MMPs, matrix metalloproteinases)，它是一族依赖Zn2+的蛋白酶家族。其中间质胶原酶(人为MMP-1，大鼠为MMP-13) 主要降解I，III型胶原，在阻止肝脏ECM过度沉积中起着主要作用。进一步研究表明MMPs活性可被特异性抑制物-金属蛋白酶组织抑制因子（TIMPs, Tissue Inhibitor of Metalloproteinases）所抑制，其中 TIMP-1抑制作用显著高于TIMPs家族中的其他成员。TIMP-1通过对间质胶原酶活性的抑制，可引起I、III型胶原等ECM主要成分降解减少，导致ECM在肝脏内过度沉积，从而促进了肝纤维化的形成与发展。因此若减少甚至阻断大鼠肝脏中TIMP-1基因的表达，理论上可减弱TIMP-1对间质胶原酶活性的抑制作用，从而释放间质胶原酶活性，增加ECM的降解，从抑制ECM增生的角度达到治疗肝纤维化的目的。研究表明肝内MMPs的来源主要是肝脏星形细胞(hepatic stellate cell HSC)，HSC在肝纤维化发生时被激活，转化为肌成纤维样母细胞，合成MMP-1等参与肝脏ECM的降解，并且大量合成TIMP-1。 HSC在肝纤维化过程中居核心地位，HSC体外活化过程可以模拟肝纤维化的体内发展过程。本研究旨在构建反义TIMP-1真核细胞表达质粒，并应用阳离子脂质体将其携带导入大鼠HSC中，检测外源质粒在HSC中的表达，同时体外观察外源质粒对实验性肝纤维化的影响，这可能有助于为将来临床慢性肝病肝纤维化的治疗提供新的有效途径。 方法：根据大鼠TIMP-1全基因cDNA序列设计PCR扩增用套式引物，运用巢式RT-PCR及基因重组技术扩增TIMP-1片段，分离、回收和纯化TIMP-1 PCR产物，经与T载体连接后转染JM-109大肠杆菌，通过IPTG/X-gal蓝白筛选后构建T载体克隆-PT/ TIMP-1，再从中切下目的片段，反向插入到真核细胞表达质粒pcDNA3中，即构建了真核细胞表达质粒pcDNA3/反义TIMP-1，再转染JM-109菌株。通过酶切鉴定及DNA测序分析证实TIMP-1反义真核细胞表达质粒构建成功。大量提取大量提取质粒。应用含I型胶原酶和链丝菌蛋白酶E的肝脏灌注液原位灌注肝脏，通过梯度离心方法，离心后得到HSC，应用台盼蓝拒染法辨别 WP=6 细胞活力，计数后培养。细胞爬片后应用免疫组化方法检测细胞Desmin和α-SMA表达，证实所分离的细胞系肝星形细胞。通过脂质体将该反义表达质粒转染至大鼠HSC内，以G418筛选阳性细胞克隆；同时以脂质体携带荧光蛋白表达质粒 pEGFP转染HSC，并用荧光显微镜观察细胞，评估转染效率。运用Northern blot方法检测外源导入质粒在HSC中的表达情况；运用Western blot法检测HSC中TIMP-1蛋白质水平的表达、HSC中I，III型胶原的含量；通过FITC-标记的I型胶原底物测定HSC 培养上清液中间质胶原酶活性的改变情况。实验结果采用SPSS软件作方差分析（多样本均数的两两比较）。 结果：运用胶原酶原位灌注及梯度离心方法成功分离了大鼠HSC。脂质体携带质粒的转染HSC的效率约在12%左右。在G418筛选转染的细胞中，运用Northern blot方法可在反义转染组及空质粒转染对照组HSC中检测到外源导入质粒的表达；与空质粒转染对照组、未转染细胞对照组相比，反义TIMP-1转染组HSC中TIMP-1 mRNA表达水平及蛋白质表达水平均显著下降（P0.01）；而间质胶原酶的活性明显增加（P0.05）；导入的反义TIMP-1质粒可明显减少反义转染组HSC中I，III型胶原的含量（P0.01）。而空质粒转染组与未转染细胞对照组相比，在TIMP-1 mRNA及蛋白质水平、间质胶原酶活性以及I，III型胶原含量方面无显著性差异（P0.05）。 结论：反义TIMP-1真核细胞表达质粒可明显抑制HSC中TIMP-1的表达，降低和减弱TIMP-1对间质胶原酶的抑制作用，从而释放HSC内间质胶原酶的活性，在体外对实验性肝纤维化有较强的减少HSC中胶原含量的作用。为临床慢性肝病肝纤维化的基因治疗提供新的可能的有效途径。