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P9-ZFD蛋白的表达、亚细胞定位及其在MG病因机制中的作用

任明山  
【摘要】: 重症肌无力(Myasthenia gravis, MG)主要是由乙酰胆碱受体抗体(AChR Ab)介导的、细胞免疫依赖性、补体和多种细胞因子参与的针对神经-肌肉接头(NMJ)处突触后膜上乙酰胆碱受体(AChR)的自身免疫性疾病,主要靶器官是骨骼肌。但是,临床上仍有15%以上的MG患者血清中无法检测到AChR抗体(SNMG),以及AChR抗体效价的高低也与疾病的严重程度和预后无绝对的相关性。另外,血浆交换治疗对SNMG患者同样具有良好的治疗效果,将SNMG患者的血清给实验动物注射后同样可引起实验性自身免疫性MG(EAMG)。这些结果均提示, MG确切的免疫病因机制实际上至今仍不完全清楚。病人体内必定还存在针对靶器官其它未知抗原表位的自身抗体。由T辅助淋巴细胞分泌的细胞因子通过影响细胞调控的免疫反应及自身抗体的产生可参与MG的发病机制。 目前的研究结果表明,在MG的自身免疫病理过程中,随靶器官骨骼肌组织的损伤和破坏,释放了许多自身抗原或多肽,并呈现在抗原递呈细胞(APC)的表面,重新激活自身反应性T淋巴细胞和/或B淋巴细胞, 释放各种细胞因子而导致MG的发生和发展。尤其在一些对致敏自身反应性淋巴细胞调控存在明显缺陷的基因易感人群中,包括Titin和TNFR在内的许多隐源性自身抗原或多肽的表达水平均明显地上调。其中肿瘤坏死因子(TNF)可通过与TNF-TNFR1信号通路中其它细胞因子的相互作用而影响自身免疫的病理过程。因此,我们认为MG的自身免疫病理过程应该是由一种以上的起动因素和多种发病机制累积致病的结果,并且受到基因和环境因素的影响。 P9基因是近年我们通过DD-PCR技术筛选获得的一个MG相关新基因,经同源性对比分析,它与己知基因的同源性不足1%,主要在骨骼肌、胸腺等MG的靶器官组织中表达,并且在伴胸腺增生及胸腺瘤MG患者骨骼肌中mRNA的表达水平明显高于对照组患者。该基因全长3442 bp,编码709个氨基酸。考虑到该基因较大,如果对其全长基因进行表达和研究,技术要求高,难度很大。因此,我们通过InterPro等著名蛋白数据库对P9基因进行了检索分析,发现它包含了TRAF型锌指结构域(简称P9-ZFD)和F-box二个功能域,以及三个可能的跨膜区。其中的P9-ZFD功能域是一个具有重要功能的衔接子蛋白,它 WP=7 通过在细胞膜和胞浆部位的表达,其TRAF2区作为TNF诱导产生的细胞膜多蛋白受体复合物(MPRC)的一部分,可偶联与TNF-TNFR1信号传导通路有关的细胞因子,影响T细胞介导的免疫反应及间接地调节自身抗体的产生。 因此,它与MG的病因机制可能具有十分重要的关系。于是,我们选择了P9-ZFD这个重要的基因功能段,运用基因工程技术对其进行克隆、表达和纯化,并制备和提纯相应的多克隆抗体, 来进一步研究1)MG和非MG患者骨骼肌组织中P9-ZFD蛋白的原位表达及其亚细胞结构定位;2)不同人体组织中P9-ZFD蛋白的表达水平,以及不同临床和病理类型MG、非MG和其它肌肉疾病(OMD)患者骨骼肌组织中P9-ZFD蛋白表达的差异性,以求阐明P9-ZFD蛋白在MG自身免疫病理过程中的作用机制。 第一部分 P9基因二级结构域、跨膜区和信号肽结构分析预测 为了正确、有效地克隆和表达P9基因,我们首先利用InterPro、PSIpred、Toppred and SignalP等著名数据库资源对P9基因的二级结构域、跨膜区及信号肽结构等重要数据进行了分析和预测。检索结果显示:P9全长基因包含了P9-ZFD和F-box二个功能域,其中P9-ZFD结构域是一个具有重要功能的衔接子蛋白,它通过在细胞膜和胞浆部位的表达,其C端TRAF2区作为TNF诱导产生的细胞膜MPRC的组成部分,偶联与TNF-TNFR1信号传导通路有关的细胞因子和通路特异性酶, 调节细胞凋亡、自身抗体的产生及影响T细胞介导的自身免疫反应。此外,P9基因在29-49; 169-189 和437-457氨基酸位点处具有三个可能的跨膜区。因此,P9基因中的P9-ZFD结构蛋白可能与MG的发病具有十分重要的关系。 第二部分 P9-ZFD重组蛋白的表达、纯化及其抗体制备 运用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法, 从人骨骼肌组织中扩增出编码P9-ZFD基因片段的cDNA,将Nde I 和 Xho I 双酶切获得的P9-ZFD目的基因片段定向插入到pET-24a表达载体中,在其3’端添加6个组氨酸密码子后,将其亚克隆至大肠杆菌E.Coli. BL21(DE3)表达系统中进行胞内诱导表达。表达产物通过Ni-NTA-Agrose亲和层析和进一步从SDS-PAGE凝胶中电洗脱回收目的蛋白的方法纯化P9-ZFD蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳检测,纯化的P9-ZFD蛋白的分子量约30 kD,其与预计的分子量大小完全一致(其中包括目的基因的编码序列及表达载体上的组氨酸Taq序列),蛋白纯度达到了95% WP=8 以上。用P9-ZFD纯化蛋白作为免疫原,免疫新西兰大白兔制备P9-ZFD多克隆抗体。采用琼脂双向扩散法和ELISA法对P9-ZFD抗体效价进行检测。并采用饱和硫酸铵(ASA)分级沉淀法和蛋白G亲和层析法提纯其中的IgG组分。最后经免疫印迹法证实了P9-ZFD抗体的免疫特异性。 第三部分 骨骼肌P9-ZFD蛋白的原位表达及亚细胞定位 为了深入探讨P9-ZFD蛋白在骨骼肌组织细胞中的表达靶位以及可能涉及的病因机制,运用免疫组织化学和免疫电镜技术,我们对MG


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