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常见病原菌快速基因诊断系统的实验与临床研究

薛建亚  
【摘要】: 随着分子微生物学和分子化学的飞速发展,对病原微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等一般检验上,而是从分子生物学水平上研究生物大分子,特别是核酸结构及其组成部分的研究。在对细菌DNA结构研究中发现细菌核糖体RNA是细菌生命的标志,在标本中检测出rRNA则说明正受到细菌感染。近几年来,对细菌16S rRNA基因研究发现,其核苷酸序列具有高度保守性,同时它的保守性又是相对的,在不同科、属、种间都具有一定的变异,利用其可对细菌进行鉴定分类,为对细菌感染性疾病进行基因诊断提供了新的方法。而传统的细菌培养方法最大的弱点是慢且阳性率低,难以适应现当代临床对细菌感染所致的疾病诊断的要求。PCR技术的应用为临床诊断提供了快速和敏感的检测方法。基因芯片技术是新一代的基因诊断技术,其主要特点是快速、高效、敏感、经济,现已成为当今多学科交叉、综合的前沿研究热点。本课题利用细菌16S rRNA基因的一系列特点,设计合成PCR反应引物及部分细菌特异性探针,构建基因芯片,并利用芯片对细菌进行快速诊断作系列探讨研究。 第一部分 细菌16S rRNA基因的扩增及应用 目的:利用细菌16S rRNA基因的结构特点,设计细菌16S rRNA基因扩增的引物,并判定引物的特异性与敏感性,利用其对细菌进行检测鉴定。方法:在细菌16S rRNA基因保守区设计所有细菌PCR反应的通用引物,通过对PCR反应条件的优化等措施,建立合适的PCR反应条件,通过对多种细菌DNA、2种病毒DNA及人血白细胞DNA进行扩增,利用琼脂糖凝胶电泳等检测方法确定引物的特异性及敏感性。结果:利用设计的16S rRNA基因的PCR反应引物进行扩增,所有细菌均可产生371bp的扩增产物,而2种病毒DNA及人血白细胞DNA均未见有相同的扩增产物出现;通过对引物敏感性检测,该引物能检测出约10个大肠埃希菌。结论:设计合成的PCR反应引物对细菌的扩增具有较高特异性及灵敏性,可应用该引物对标本进行扩增检测并应用于基因芯片的检测。 第二部分 快速诊断基因芯片的构建 WP=5 目的:利用细菌16S rRNA基因的特点,设计革兰阳性菌、革兰阴性菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌的特异性探针,构建成基因芯片,用于对细菌检测。方法:在细菌16S rRNA基因保守分别设计合成革兰阳性菌、革兰阴性菌的通用探针,在其可变区设计合成肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌的特异性探针,制备成基因芯片,通过对杂交条件的优化以获得最佳检测结果。用不同细菌的扩增产物检测所制备的芯片特异性及敏感性。结果:成功制备完成可用于细菌检测的基因芯片,建立了最佳的杂交条件。本基因芯片不仅能对单一菌种的DNA进行检测,还能对不同细菌DNA的混合样品准确地检测区分。结论:基因芯片构建成功,并可用于对细菌的检测鉴定,为应用到临床标本的检测奠定基础。 第三部分 基因芯片的临床应用 目的:利用所制备的基因芯片,通过对临床标本的检测,探索其临床应用前景。方法:无菌采集临床标本,对标本进行常规培养及鉴定,同期利用设计合成的特异性引物对标本进行PCR扩增,对扩增结果以凝胶电泳检测进行初步判断有无细菌存在,再利用所制备的基因芯片进一步确定为何种病原菌,并比较该方法与普通培养特异性及敏感性。结果:对所有18份标本进行了检测,其中常规培养阳性7,其对应标本PCR反应结果均呈阳性结果,通过芯片检测亦能正确检出,而11份常规培养阴性的标本中,PCR结果提示阳性的有2份,其中1份为使用抗生素后的结果。两种检测方法具有显著性差别(Χ2=8.42,P0.01)。整个检测结果在5小时内即可完成。结论:本芯片可用于临床标本的检测,对使用抗生素后的临床标本亦有一定的诊断价值。用基因芯片检测具有较高的特异性及敏感性,且费时较少。


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