MnSOD基因转染及丹参酮对胃癌细胞生长的影响及其分子机制

【摘要】： 第一部分 不同分化胃癌细胞株内超氧化物歧化酶的表达及内源性活性氧水平 目的 检测正常胃粘膜及MKN-28、SGC7901、BGC823、HGC-27四种不同分化的胃癌细胞株内锰型超氧化物歧化酶（MnSOD）mRNA的表达，评价MnSOD转录水平与肿瘤细胞分化程度、胞内活性氧(ROS)水平及增殖活性的相关性。 方法 利用酶底物催化方法测定四种胃癌细胞株的碱性磷酸酶（ALP）及乳酸脱氢酶（LDH）活力。RT－PCR方法检测正常胃粘膜组织及MKN-28、SGC7901、BGC823、HGC-27四株高、中、低、未分化胃癌细胞株内的MnSOD mRNA的表达。利用2'7'-二氯氢化荧光素二酯（DCFH－DA）荧光染色方法检测不同分化胃癌细胞株的胞内ROS水平。四唑蓝（MTT）比色法测定不同分化胃癌细胞株的增殖活性并绘制生长曲线。 结果 MKN-28、SGC7901、BGC823、HGC-27四株细胞ALP及LDH的酶活性有显著差异。不同分化胃癌细胞内的MnSOD表达普遍低于正常胃粘膜，且随分化程度减低而逐步下降；其胞内ROS水平随MnSOD表达的下降而逐步上升，同时肿瘤增殖活性上升。 第二部分 MnSOD基因转染对SGC7901胃癌细胞增殖的影响 目的 观察改变胞内MnSOD基因表达水平对SGC7901胃癌细胞增殖的影响。 方法 采用电穿孔方法将反义和正义MnSOD cDNA真核表达载体pHβA-SOD (-)/pHβA-SOD (+)转染SGC7901胃癌细胞，400mg/LG418筛选稳定表达克隆并用RT-PCR及Western杂交法鉴定后扩大培养。用pHβA空质粒转染作为对照。放射免疫法检测正义、反义及空载SGC7901胃癌细胞株内的铜锌超氧化物歧化酶（CuZnSOD，SOD1）蛋白含量。分别用直接细胞计数法、四唑蓝（MTT）比色法、平皿克隆形成率试验及裸鼠移植瘤模型测定三组细胞在体外、体内的增殖活性。 结果 与空载组（Vector－7901）相比，转染正义质粒的MnSOD-7901胃癌细胞呈现抑增殖效应：(1) 生长曲线示增殖速度减慢； (2)在平皿上的集落形成能力下降；(3)在裸鼠体内的成瘤性明显受抑制。转染反义质粒的MnSOD-AS7901胃癌细胞则出现促增殖效应：(1) 生长曲线示增殖速度加快； (2)在平皿上的集落形成率上升；(3)裸鼠移植瘤生长加速。 第三部分 MnSOD调控SGC7901胃癌细胞增殖的分子机制 目的 进一步研究MnSOD高、低表达调控SGC7901胃癌细胞增殖的分子生物学机 WP=4 制。 方法 采用DCF－DA荧光染色法检测MnSOD－7901、MnSOD－AS7901及Vector－7901三组细胞的胞内ROS水平；透射电镜观察细胞超微结构改变；流式细胞仪（FCM）检测细胞周期；免疫组化法检测P53、Bcl－2、Ki67、C-erbB2 的蛋白表达。RT－PCR检测三组细胞的P53mRNA表达。 结果 与Vector－7901相对照，MnSOD－7901细胞胞内ROS水平下降， G0/G1期细胞比例增高，S期细胞减少， Ki67表达明显抑制， Bcl-2及C-erbB2表达轻度下调。MnSOD－AS7901细胞胞内ROS水平上升， G0/G1期细胞减少，S期细胞增多， Ki67表达明显升高， Bcl-2及C-erbB2表达轻度上升。此外，MnSOD－7901 细胞及MnSOD－AS7901细胞的电镜下超微结构发生改变。 第四部分 丹参酮ⅡA诱导SGC7901胃癌细胞凋亡的研究 目的 观察抗氧化剂丹参酮ⅡA（TanⅡA）在体外对SGC7901胃癌细胞的作用，并对其分子机制作初步研究。。 方法 分别采用1.0mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L、6.0 mg/L、8.0 mg/L、10.0mg/L的不同浓度梯度的TanⅡA干预SGC7901胃癌细胞24、48、72小时后，用MTT比色法绘制肿瘤细胞生长曲线。采用1.0mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L、6.0 mg/L、8.0 mg/L、10.0mg/L的不同浓度梯度的TanⅡA干预SGC7901细胞24小时，或同样采用10.0mg/L的TanⅡA干预0、12、24、36、48小时，应用碘化丙叮（PI）及Annexin V双重染色法，通过流式细胞仪观察不同浓度梯度及不同时间梯度干预下的SGC7901细胞凋亡率及坏死率。用透射电镜直接观察细胞凋亡形态并拍摄照片记录。用RT－PCR检测1.0mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L、6.0 mg/L、8.0 mg/L、10.0mg/L的TanⅡA干预24小时后SGC7901细胞P53的mRNA表达。 结果 抗氧化剂TanⅡA在体外具有良好的抗肿瘤效应，呈现时间依赖性及浓度依赖性地诱导SGC7901细胞坏死及凋亡。随着TanⅡA干预浓度的逐步上升，胞内 P53mRNA表达亦逐步上升。 结 论 (1) 胃癌细胞内 MnSOD的表达低于正常，MnSOD的表达水平与胃癌分化程度、胞内ROS水平及肿瘤增殖活性密切相关。 (2) 通过基因转染提高胞内MnSOD 的表达可抑制胃癌细胞的增殖，MnSOD可能是胃癌基因治疗的一个新靶点。 (3) MnSOD抑制胃癌细胞增殖的机制与下调胞内ROS水平，G0/G1期细胞周期阻滞，上调P53表达，下调Ki67、 Bcl-2及C-erbB2表达有关。 抗氧化剂丹参酮ⅡA在一定浓度范围内呈时间依赖性及剂量依赖性地诱导胃 WP=5 (4) 癌细胞坏死及凋亡，机制与P53表达上调有关。