Graves病肝功能损害的动物实验研究

【摘要】： 目的 通过核酸免疫，建立Graves病动物模型。在动物模型的基础上，了解Graves病肝脏损害的病理变化及其发病机制，并进一步探讨Graves病肝功能损害时小鼠基因群表达水平上的变化，寻找Graves病肝脏损害相关基因。 方法 选取6~8周龄的雌性BALB-c小鼠60只，分别在0周、第4周、第8周、第12周对其中45只小鼠进行hTSHR-pcDNA免疫，其余15只注射生理盐水做空白对照。16周时处死所有小鼠。分析各时间点（0周、第4周、第8周、第12周、第16周）小鼠的体重、血清TsAb、TSH、TT4以及ALT值的变化。并在16周时对小鼠甲状腺进行称重、免疫组化分析以及小鼠肝脏组织电镜观察。 16周时按照TsAb值把所有实验小鼠分成三组：Graves病组（免疫小鼠，TsAb升高）、阳性对照组（免疫小鼠，TsAb正常）、空白对照组（正常小鼠）。观察三组小鼠ALT的变化、肝组织在电镜下的不同表现，以及Graves病小鼠TsAb、TT4和ALT三个指标之间的关系。 将Graves病小鼠按ALT水平分成两组：对照组（ALT正常水平）和实验组（ALT水平升高），从两组小鼠的肝组织中提取mRNA，逆转录后分别用Cy5（实验组）和Cy3（对照组）荧光标记，获得两组动物来源的cDNA探针，分别与Biodoor基因表达谱芯片杂交，结果用Scan Array4000扫描仪扫描并用GenePix Pro 3.0软件分析扫描结果。重复两次后，对表达水平差异（上调或下调）显著的基因进行RT-PCR验证。 结果 16周时，14只免疫小鼠出现了TsAb升高，并伴有TSH下降、TT4升高、甲状腺重量增加、甲状腺组织淋巴细胞浸润、体重减轻等典型Graves病表现。与其它小鼠（包括TsAb正常的免疫小鼠和对照组小鼠）相比有显著性差异。对TsAb升高的免疫小鼠（Graves病小鼠）各指标之间的相关性分析结果表明，TsAb与TT4、TsAb与甲状腺重量呈显著正相关。 实验结束时，64.3％的Graves病小鼠出现ALT升高，非Graves病免疫小鼠和对照组小鼠的ALT值都在正常范围。按ALT正常与否，对16周时的Graves病小鼠进行分组后发现，这两个亚组之间的TsAb或TT4水平同样存在显著性差异，ALT升高的Graves病小鼠TsAb或TT4水平明显高于ALT正常的Graves病小鼠。肝组织的电镜观察则发现，ALT升高的Graves病小鼠肝细胞线粒体明显肿胀；细胞间隙增宽，部分细胞核有深切迹；胞浆内出现大量脂滴，并有较多的脂褐素沉积；毛细胆管有深色物质沉积。ALT正常的Graves病小鼠线粒体轻度 WP=5 肿胀，并可观察到少量的脂肪滴。TsAb正常的免疫小鼠和空白对照小鼠的肝组织在电镜下基本正常。 Graves病肝功能损害小鼠的肝组织基因表达谱差异研究结果表明，（1）Graves病ALT升高小鼠有17条基因表达谱发生明显的变化，其中新基因11条，已知基因6条；（2）在Graves病ALT升高小鼠中表达增高的已知基因2条，表达下降的已知基因4条，其中，黄嘌呤脱氢酶（上调）、葡萄糖激酶活性相关基因1以及Prss8蛋白水解酶（下调）的变化幅度最大。 综上所述，本研究采用核酸免疫的方法，成功建立了Graves病动物模型。在此基础上，进一步阐明了Graves病时肝功能损害的病理特点、肝功能损害与甲状腺激素水平（TT4）和TsAb水平的相关性，并通过基因表达谱分析，初步筛选出了Graves病肝功能损害的相关基因。研究结果对Graves病及其肝功能损害的发病机制和临床治疗具有重要的理论意义和实用价值。 结论 1、利用人TSHR免疫BALB-c小鼠可以成功地构建Graves病动物模型； 2、自身免疫和高甲状腺激素水平是Graves病肝功能损害的两大重要因素； 3、Graves病肝功能损害时，病理学上可表现为特征性的巨型线粒体，同时还可出现肝细胞脂肪变性等一些非特异性改变； 4、Graves病肝功能损害小鼠部分基因发生差异表达，提示这些基因与肝功能损害有关。 关键词 核酸免疫;BALB-c小鼠;Graves病;肝脏损害;发病机制;基因表达谱;基因芯片