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人脑金属硫蛋白MT3结构对其性质和功能的影响

郑起  
【摘要】:阿尔茨海默氏症 (Alzheimer’s disease, AD) 是一种中枢神经系统原发性退行性变性疾病,临床主要表现为认识能力降低、行为异常及日常生活能力逐渐下降而需要照顾。统计结果表明,Alzheimer’s disease是威胁老年人群健康的主要病种之一,85岁以上人群发病率可高达50%。美国1994年仅花费在Alzheimer’s disease病人护理上的费用就高达1100亿美元。迄今为止,Alzheimer’s disease的病因及发病机制还是个不解之谜。然而,大量研究结果表明,AD的发生是多病因相互作用的结果,可能存在多种致病机制。全面、深入地了解各种致病机制对于最终征服AD具有重大的意义。 研究发现,AD患者大脑中缺乏一种神经元的抑制因子,即神经生长抑制因子 (Growth Inhibitory Factor, GIF)。该因子的缺少致使AD病人脑中神经营养活性增高,从而导致神经元过度生长。这种畸态的生长使得大脑营养水平供不应求,并最终导致了神经元的纤维化。这也是AD可能的致病机制之一。 从结构上看,GIF应该属于金属硫蛋白家族,因此它也被命名为MT3。从一级结构上看,MT3仅仅比MT1多了7个氨基酸,其同源性高达70%以上。然而,与人们已经熟知的MT1/2不同,MT3特异性地表达于中枢神经系统当中,并且具有独特的生物学活性,即神经生长的抑制活性。造成二者功能上如此巨大差异的原因何在?我们从结构-性质-反应-功能的相互关系角度对这个问题进行了考察。 由于MT3在脑内含量很低,提纯不易,大大限制了MT3的研究,因此我们决定采用基因工程的方法来制备MT3。首先,我们构建了人MT3的基因,经测序正确后转入GST融合蛋白的表达体系,通过优化酶切条件和分离方案,确定了GSH Sephrose 4B ( Superdex 75 ( Sephadex G25的分离流程和一系列的试验条件,最终获得了高表达、高纯度的MT3蛋白。蛋白经SDS-PAGE、ESI-MS鉴定,组分单一且与理论预期值完全相符。经反复试验,证实该酶切及分离方案适用范围广,可几乎不加修改地应用于各种MT3突变体的分离、提纯过程,包括长期以来一直被认为较难表达纯化的 (-单结构域。 对MT3系统的性质研究非常少,我们在此作了一些探索性的工作。实验结果表明,MT3在化学稳定性方面明显不如MT1,其 (-结构域络合常数较MT1要小约1个数量级(8.4(1019 M-1 vs 5.6(1020 M-1)。而且,MT3中两个结构域在酸滴定过程中并不像MT1那样呈现出明显差异的两相曲线,这预示着MT3中两结构域之间稳定性的差异较小。CD酸滴定过程表明,MT3的酸滴定过程不是两结构域简单的一前一后分别解离过程,中间可能存在金属硫键的重排。1H-15N HSQC的结果更加清楚地说明,在一定酸度范围内存在着 (、(-结构域同时解离的现象。与小分子配体的反应也反映出类似的情况。在等同实验条件下,MT3与EDTA反 WP=7 应的速率常数约为MT1的四倍,这进一步证明MT3中的金属硫簇较MT1中的更不稳定,部分金属硫键更弱。MT3与DTNB的反应也比MT1要快,这一结果显示MT3中的金属硫簇暴露于溶剂中的程度更大,这部分是由于其 (-结构域本身结构较为松散,同时还源于其 (-结构域中特有的CPCP motif,两个连续的Pro使蛋白肽链在此产生明显的弯折,导致金属硫簇更加暴露。我们推测,这种暴露性对于MT3的性质和功能有着决定性的意义。此外,MT3也更容易被生物酶所降解,如采用Trypsin进行1周的模拟消化,MT1能够维持完整结构不被破坏的约占60%,而等同条件下仍能保持完整的MT3只有约18%。 为了揭示性质差异的起源,我们通过多种谱学方法来考察了Cd7-MT3的结构。实验结果表明,Cd7-MT3能够很好保持其结构的完整性,UV、CD光谱都呈现出特征的金属硫簇电荷转移吸收带,没有明显的氧化朕兆。Raman光谱显示,蛋白中的巯基都参与了金属离子的配位,既不存在自由的巯基,也没有二硫键形成。然而,与MT1相比,MT3的结构明显比较松散。柱层析的结果显示,MT3的Stoke’s半径较大,在等同实验条件下其保留时间较短。通过NMR对蛋白的三级结构进行解析可以说明为什么存在这种松散性。研究发现:MT3中 (-结构域折叠较为紧密,而 (-结构域中长程NOE信号非常少。(-结构域中,除53-60位以外,蛋白的肽链可变性都不大且总体走向与MT1极为相似,然而,G53-E60一段肽链却没有一种能量上占明显优势的构象,它可以随环境条件的变动较为灵活的调整。这点是造成MT3独特性质的重要因素之一。同时,柔性的G53-E60肽段也可能是蛋白-蛋白相互作用中理想的结合位点。 与Cd7-MT3相比,Zn7-MT3的稳定性明显较低,其酸滴定曲线的突跃中点大约在4.9,而且Zn2+在pH 7.0时就开始发生解离。在pH 6.0时重组、纯化的Zn7-MT3在Raman光谱上可明显看到507 nm处的二硫键吸收。Zn7-MT3与EDTA的反应速率比Cd7-MT3要快得多,EDTA浓度为1 mM时,其快反应速率为5.1(10-3 s-1,约是Cd7-MT3(1.2(10-3 s-1)的4倍,而同DTNB的反应速率则与Cd7-MT3相近,预示着金属硫簇的暴露程度Zn7-MT3与Cd7-MT3差不多。 为了进一步求证其结构对性质和功能所产生的影响,我们有目的地构建了一系列突变体蛋白。通过对突变体蛋白和野生型MT3的比较,我们可以进一步加深对MT3结构-性质-功能之间相互关系的认识。 MT3在一级结构上最显著的特征之一就是在第55-60位之间插入了一段富含Glu的六肽,为考察这个酸性六肽loop对蛋白性质的影响


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