引入反向重复序列的腺病毒在肝癌介导选择性表达和溶瘤

【摘要】：腺病毒载体目前广泛应用于肿瘤基因治疗的基础研究和临床试验。近年来发展了一些新的载体构建策略使其效应获得肿瘤选择性，引入反向重复序列便是其中之一。E1基因删除的腺病毒载体能选择性地在肿瘤细胞中复制病毒DNA，在其目的基因两侧插入反向重复序列，当病毒DNA在肿瘤细胞中复制时介导同源重组，激活目的基因，实现基因转移的肿瘤选择性。我们研究了根据这个策略构建的载体Ad．IR-BG在原发性肝癌和结肠转移性肝癌实验性治疗中的效果。 我们首先证实Ad．IR-BG在体外能选择性地在肝细胞癌(SMMC7721、MHCC97)和结肠癌(LoVo、HT29)细胞中表达报告基因(β-gal)，而在正常肝细胞(WB)中的表达水平极低。不含反向重复序列的腺病毒载体Ad．BG表达β-gal没有选择性。通过尾静脉注射，Ad．IR-BG能选择性地在SMMC7721和LoVo裸鼠肝脏移植瘤内表达β-gal，肿瘤和瘤周肝表达比显著高于Ad．BG。使用DNA合成抑制剂羟基脲能抑制Ad．IR-BG感染的肿瘤细胞内病毒DNA的重组及β-gal的表达，而不影响Ad．BG的表达。这些结果说明Ad．IR-BG表达目的基因依赖病毒DNA在肿瘤细胞内复制和重组，非肿瘤细胞被其感染后无此过程，目的基因因此不表达，是选择性表达的机制。 我们进一步发现，Ad．IR-BG还能选择性在肿瘤细胞中产生溶瘤效应(Oncolysis)。Ad．IR-BG感染的SMMC7721和LoVo细胞发生明显的生长抑制和病理形态变化，利用“再感染”试验和实时PCR，在其培养液中能检测到具有感染性的病毒颗粒且数量呈指数增长，提示是病毒大量复制引起溶瘤。Ad．IR-BG局部注射能抑制SMMC7721和LoVo肝脏移植瘤的生长，显示直接的肿瘤杀伤作用，而Ad．BG无此作用。尽管Ad．IR-BG感染的WB细胞内也存在病毒DNA复制，却检测不到病毒颗粒，Western印迹在Ad．IR-BG感染的SMMC7721和LoVo细胞中能检测到病毒衣壳蛋白，WB细胞则无。说明肿瘤细胞和正常细胞对病毒衣壳蛋白合成的激活存在差别，可能是Ad．IR-BG在肿瘤细胞中选择性地复制的原因之一。 引入反向重复序列的腺病毒载体Ad．IR-BG除选择性地在肝癌中表达目的基因外，还能在肿瘤细胞内复制引起溶瘤效应而产生直接杀伤作用，这是本研究的新发现。这种联合基因转移和溶瘤效应并具有肿瘤选择性的腺病毒载体可成为肝癌基因治疗的新方向。