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NF-κB调控氧化LDL激活系膜细胞TGF-β1转录的研究

兰洋  
【摘要】:高脂血症是肾脏病发生和发展的高危因素之一。低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)和氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, Ox-LDL)与细胞膜上受体结合,或LDL在氧化过程中产生的脂质过氧化物如溶血磷脂酰胆碱等,可促使肾小球细胞释放各种细胞因子、生长因子、以及趋化因子和粘附分子,导致肾小球炎症细胞侵入、肾小球固有细胞的生长增殖改变以及细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)的沉积。肾小球系膜细胞是肾小球中受外界刺激后的效应细胞和损伤后的修复细胞,参与肾病早期的细胞增殖和肾病慢性发展过程中的纤维化、硬化,在肾小球病变的发病机制及治疗研究中是重要的观察对象之一。 在多种肾脏病的治疗研究中,转化生长因子beta1(transforming growth factor-beta1, TGF-β1)的表达是衡量疗效的有效指标之一。TGF-β1调节着细胞外基质的合成和分解,调节细胞的生长和分化,参与机体的炎症反应、免疫反应和肿瘤的发生。肾脏病变时,TGF-β1表达上调,表现出强大的致纤维化作用,促进ECM的大量合成,抑制其降解,ECM累积,促进肾脏病慢性进行性发展。目前TGF-β1的下游事件有大量的报道,TGF-β1与其Ⅰ、Ⅱ型受体复合物结合,Ⅱ型受体激酶使Ⅰ型受体磷酸化,活化的Ⅰ型受体激活转录激活蛋白-1(activator protein-1, AP-1)和转录因子Smads,由AP-1和Smads介导目的基因的转录和表达。目前,TGF-β1上游事件的报道并不多见,肾脏病时TGF-β1表达上调的确切机制亦未明确。 核转录因子-κB(nuclear factor-κB)是普遍存在的转录因子,在免疫和炎症反应中起着重要作用,参与许多细胞因子、粘附因子、细胞因子受体、趋化因子受体、抗凋亡蛋白等基因的表达调控, 如诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、 单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)和血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)等。 WP=6 NF-κB/Rel是一个大的转录因子家族,在哺乳动物中有p105/p50、p65/RelA、p100/p52、c-Rel、RelB等,NF-κB以同源或异源二聚体与靶基因上特定的DNA序列结合,调节基因的转录,该特定序列称κB位点,核心序列是GGGRNNYYCC(R为嘌呤,Y为嘧啶,N为任意碱基)。NF-κB的活性由胞质中的抑制分子IκB调节,IκB也是一个大家族,哺乳动物中有IκBα、IκBβ、IκBγ、IκBε和bcl-3等组成,IκB分子包含有6-7个锚蛋白重复序列,锚蛋白重复序列与-κB分子的RHD相作用,覆盖NF-κB的核定位序列,使NF-κB停留在细胞质中。炎症、免疫反应、氧化应激和许多细胞因子如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、白细胞介素-1等都能激活NF-κB。目前Ox-LDL是否能激活肾小球系膜细胞中NF-κB以及可能的活化机制尚未见报道。 鉴于Ox-LDL、TGF-β1和肾小球系膜细胞在肾脏损伤中所起的作用,而Ox-LDL能刺激肾小球系膜细胞的TGF-β1表达上调,我们以前的实验也同样观察到,但其中的机制尚未完全明确,本文拟以Ox-LDL为刺激物,大鼠肾小球系膜细胞为研究对象,观察NF-κB、TGF-β1的变化,并对两者之间可能存在的关系做进一步的检测,探讨脂质肾损伤的发生机制。 Ox-LDL对系膜细胞NF-κB活性的影响 目的:观察Ox-LDL刺激大鼠肾小球系膜细胞引起的NF-κB活性变化,以及NF-κB各单体的蛋白表达水平改变,并确定活化的NF-κB中的二聚体成分。 方法:肾小球系膜细胞从SD雄性大鼠分离培养,实验用5-8代细胞。系膜细胞传代后生长至90%融合,随机分为正常对照组(N=3)和Ox-LDL(N=3)刺激组。LDL通过铜氧化法制备刺激物Ox-LDL。提取细胞核蛋白,与γ-32P-ATP标记的NF-κB 寡核苷酸探针反应后进行凝胶电泳迁移率实验,检测不同浓度和不同时间的Ox-LDL刺激后系膜细胞NF-κB活性的变化,以凝胶电泳超迁移率实验检测NF-κB的二聚体成分。NF-κB各单体的蛋白表达水平用免疫印迹分析进行检测。实验结果经灰度扫描后表示为对照组的相对积分光密度值,统计分析采用SPSS8.0软件进行。 结果:1. 系膜细胞在100μg/ml Ox-LDL刺激6h后,NF-κB结合活性明显升高(P0.05,Ox-LDL处理组vs正常对照组:4.28±0.67 vs 1),12h、18h、24h也比正常对照组明显上升,但活性却较6h明显下降,在刺激后36h又明显升高,明显高于24h(P0.05,36h vs 24h:3.86±0.65 vs 1.54±0.33),在48h、60h、72h、84h、90h各时间点观察到NF-κB活性均明显高于正常对照组,与36h相比较无明显差异。在不同浓度的Ox-LDL刺激系膜细胞36h后,NF-κB活性随Ox-LDL WP=7 的刺激浓度的上升而升高。2. 凝胶超迁移率实验显示,加入p52、p50、p65、c-Rel、RelB的抗体与核抽提物作用后,再加入同位素标记NF-κB探针反应,非变性凝胶电泳时p50、p65抗体加入后形成超阻滞条带,显示Ox-LDL激活系膜细胞的p50、p65,可能与p52、c-Rel、RelB无关。3. 免疫印迹分析对Ox-LDL刺激后系膜细胞的NF-κB的各单体的蛋白表达水平检测,结果显示Ox-LDL对p52、c-Rel、RelB的蛋白表达无明显影响,p50、p65单体的蛋白表达量则随Ox-LDL刺激时间的延长而明显上升,与凝胶超阻滞分析的实验结果相符。 结论:Ox-LDL随时间延长持续激活肾小球系膜细胞的NF-κB的活性,


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