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细胞周期G1期调控分子在白血病细胞、淋巴瘤细胞以及CD34~+细胞增殖、分化、凋亡中的作用

王钦红  
【摘要】:肿瘤细胞不同于正常细胞的特征在于其不断的自我复制、顽固的逆分化和凋亡。细胞增殖失控是肿瘤发生的重要环节,与细胞周期调控紊乱密切相关。我们从细胞周期调控角度探讨了G1期重要的调控分子在血液系统肿瘤细胞以及造血干/祖细胞增殖、分化、凋亡中的作用。 论文第一部分,我们以六亚甲基二乙酰胺(HMBA)体外处理HL-60、U937细胞建立肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡模型,研究Cyclin D、Cyclin E、p27及相关基因c-myc、Rb、Bcl-2在该细胞模型中的表达变化及其意义。结果表明,HMBA干预HL-60、U937细胞72小时后,CD11b表达显著升高(如4mMHMBA处理组CD11b分别达69.90±5.02%、46.41±7.80%);高剂量HMBA促使Annexin-V表达增加(4mMHMBA组分别为8.90±0.81%、11.23±5.57%);同时细胞周期分析显示HL-60、U937细胞大量阻滞于G1期。在所建立的这一细胞增殖、分化、凋亡模型中,我们发现Cyclin D、p27表达显著增高,呈剂量依赖关系(如在HL-60细胞中4mM组Cyclin D表达为63.00±13.55%,p27为67.65±10.49%);而Cyclin E表达明显下调(如HL-60细胞4mM组Cyclin E表达为1.33±0.23%),也呈剂量依赖关系。相关基因c-myc、Rb、Bcl-2的表达在该细胞模型中也发生显著的改变(如HMBA可使HL-60细胞c-myc、Bcl-2 mRNA表达均下调,而Rb mRNA表达则上调)。结果提示Cyclin E、p27以及有关的相关基因可能参与了白血病细胞的增殖、分化、凋亡机制,因此设法下调Cyclin E、上调p27就有可能为抑制肿瘤细胞的增殖和促使其分化、凋亡提供新的策略。从细胞周期的角度探索细胞增殖、分化、凋亡的机制国内外文献鲜见报道。 在第二部分,我们以p27基因转染实验来进一步证实p27对肿瘤细胞增殖、分化、凋亡的影响。成功地构建了p27基因真核表达载体pEGFP-C1/hp27,以此载体和腺病毒载体Adp27分别转染/感染HL-60和Raji细胞。pEGFP-C1/hp27电击转染率(HL-60)为31.9%:AdLacZ感染率(HL-60和Raji)分别为40.3%、32%;RT-PCR均显示有显著的p27基因mRNA表达。p27基因导入HL-60和Raji细胞均可致明显的细胞生长增殖受抑;同时导致HL-60细胞CD11b显著增加(如72小时,pEGFP-C1/hp27转染致HL-60 CD11b表达为27.9±4.1%;Adp27感染 复口.人学医学博卜学位论文 为33.8士5.1%);Adp27感染HL一60、Raji引起显著的细胞凋亡(如72小时,Annexin V十PI一率分别达46.9士9,5%、35.7士11 .2%)。本部分结果证实了p27可显著抑制肿 瘤细胞的增殖,并显著促使其分化、凋亡,提示p27在细胞增殖、分化、凋亡中 的重要性,为可能的进一步应用p27基因进行血液系统肿瘤的基因治疗奠定基 础。未见文献报道。 论文第三部分实验中,我们以RNAi技术阻断了处于细胞周期进展核心地位 的CDKZ基因的表达。将CDKZ SIRNA质粒(pBS用6/CDKZ)经电击穿孔法转 染HL一60细胞,Rl’- PCR显示CDKZ基因mRNA的表达显著下调,并呈现出时 间依赖性;CDKZ siRNA转染后,HL一60细胞生长增殖明显受抑;同时分化标记 CDllb表达显著增高(24小时、48小时、72小时分别为17.肚2.3%、30.2士3.5 %、49.7士11 .6%)提示HL一60细胞趋向粒/单系的分化。结果表明CDKZ表达下 调参与了肿瘤细胞增殖、分化的机制,这为从细胞周期角度干预肿瘤细胞增殖、 促使其分化继而达到抗肿瘤的目的提供又一新的途径。国内外未见文献报道。 论文第四部分,我们自行构建了p27 SIKNA表达质粒(P sileneer U6一1 .0/hP 27), 测序证实有完整的插入序列,表明构建成功。将此质粒以电击方式转染脐血 eD34+细胞,转染效率为27.1一3 1 .4%;转染后Rl’- peR证实en34+细胞p27基因 mRNA表达显著下调,说明我们构建的p27 siRNA质粒有效;转染p27 SIRNA 质粒的CD34+细胞总数显著高于空质粒组(第6、9天分别为:6.1士0.2 x 106/ml vs 3.7士0.5 X 106/ml,p0.05、7.6士o.sxlo6zmlvs4.l士o.6Xlo6/ml,p0.05), 同时保留CD34标记的阳性率也显著高于空质粒组(第6、9天分别为:84.5士 6.1%Vs 48.4士3.9%,p0.05、63.3士3.2%Vs 28.7士5.4%,p0.05)。本部 分结果表明以p27 SIRNA干扰方式可致脐血.CD34+细胞明显扩增,而不影响其 分化潜能,可为体外扩增脐血CD34+细胞开辟崭新的途径,这不同于既往应用细 胞因子扩增CD34+细胞可造成细胞分化,对于提高CD34+造血干/祖细胞的移植 效能将具有十分重要的意义。未见文献报道。


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