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人类SCDR10B、LHFPL1和CYPJ基因的克隆及其编码蛋白的特征与功能研究

黄超群  
【摘要】:由于生物基因组进化中的保守性,具有某一功能的基因在不同物种之间常具有一定的同源性。这种同源性对新基因的克隆和功能研究具有指导作用。利用这种基因间的同源性,有目的的克隆基因家族新成员,已经成为新基因克隆的有效策略。本论文分为三个部分,第一和第二部分利用同源策略,克隆到新的人短链脱氢酶/还原酶基因SCDR10B和脂肪瘤HMGIC融合伴侣类基因LHFPL1,对其功能进行了初步研究,第三部分对脯氨酸异构酶Cyclophilin J 的生化特性和结构进行了研究。 短链脱氢酶/还原酶(Short-chain Dehydrogenases/Reductases,SDR)家族是一个由很多成员组成的大家族,其中大部分是NAD+或NADP+依赖的氧化还原酶。在本论文第一部分中,我们通过同源筛选的策略,用11β-HSD1为信息探针,拼接并从人脑组织cDNA文库中克隆到新基因SCDR10B。该基因编码的蛋白质具有保守的短链脱氢酶/还原酶结构域,氨基酸序列比较显示这个新的推导蛋白与11β-HSD1有较高的同源性和结构相似性,氨基酸序列的一致性为43%,可能是羟类固醇脱氢酶这个亚家族的新成员。在原核表达系统中对SCDR10B基因进行了重组表达,重组蛋白免疫兔获得了其多克隆抗体。酶活性测定结果显示,SCDR10B能以NADP+作为辅基催化氢化可的松脱氢,具有11β-羟类固醇脱氢酶活性,可能与糖皮质激素的失活有关。Northern杂交结果显示,SCDR10B转录本大小约1.7 kb,在脑中高表达。RT-PCR检测显示其在肺癌细胞株中呈高表达,免疫组化的结果也显示SCDR10B在肺癌组织中高表达,这暗示SCDR10B可能与肺癌有关。免疫组化的结果还显示SCDR10B在小脑胶质瘤和脑膜瘤中表达,在正常大脑皮层和海马神经元也有分布。 脂肪瘤为脂肪组织的良性肿瘤,是人类最常见的起源于间叶组织的肿瘤之一。这些肿瘤在细胞遗传学上的特征是染色体畸变,其中有2/3的病例在染色体12q13-15区域出现染色体易位,12q13-15 区域的畸变通常会影响到高速泳动蛋白基因HMGIC,目前,在有染色体畸变t(12;13)的脂肪瘤患者中,鉴别出了一个HMGIC易位伴侣基因LHFP(lipoma HMGIC fusion partner)。在本论文第二部分中,我们以LHFP作为信息探针,克隆到了新基因LHFPL1,该基因定位于染色体Xq23。人17种组织中的表达谱分析显示,LHFPL1基因呈广谱表达,其中肺,胸腺,骨骼肌,结肠,卵巢表达丰度高。RT-PCR检测结果显示LHFPL1基因在肝肿瘤细胞中呈低水平表达。LHFPL1蛋白含有N端信号肽以及三个跨膜结构,被预测定位于内质网,通过细胞免疫荧光定位实验得到证实,可推测LHFPL1基因在生物体内可能通过其所表达的分泌型的跨膜蛋白行使其功能。此外LHFPL1与LHFP高度同源,今后的研究中可以探讨LHFPL1基因 WP=7 在肿瘤发病中是否象LHFP基因那样通过基因融和起作用。 人类Cyclophilins是一类在进化上高度保守且具有肽酰脯氨酰顺反异构酶活性的蛋白,这类蛋白广泛存在于各种组织,其酶活性通常能被CSA抑制。近来的研究还表明,cyclophilin家族的成员除了上述脯氨酸异够构酶活性之外,还具有核酸酶活性,能降解DNA,这种核酸酶活性与凋亡核酸酶比较有许多相似之处,目前认为cyclophilin在细胞凋亡过程中可能起降解染色体DNA的作用。在本论文第三部分中,我们对本实验室克隆的cyclophilins家族的新成员CYPJ的生化特性和结构进行了研究。体外重组表达纯化获得高纯度CYPJ蛋白也具有脯氨酸异构酶活性。它是否也具有核酸酶活性呢?我们对该问题进行了较深入的研究,结果显示CYPJ在体外能降解质粒和基因组DNA,其核酸酶活性可被钙镁离子激活,被EDTA抑制,但不能被CSA抑制。凝胶迁移实验和荧光光谱的结果显示CYPJ能与DNA底物结合,这为其核酸酶活性提供了进一步依据。突变分析显示,与野生型蛋白相比,R44A突变体的脯氨酸异构酶活性明显减弱,但核酸酶活性下降不明显;与此相反,K120A突变体核酸酶活性显著降低,而脯氨酸异够构酶活性不变。我们还利用CD光谱和荧光光谱对CYPJ在不同环境条件下的空间结构进行了研究,脯氨酸短肽底物能诱导其空间构象改变,但二级结构改变不明显,抑制剂CSA引起其二级结构明显改变。突变后其二级结构发生变化从而酶活性改变,提示CYPJ的结构和功能密切相关。这些实验结果说明,CYPJ蛋白兼具脯氨酸异够构酶和核酸酶两种酶活性。


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