灰飞虱免疫相关基因及微管蛋白基因的克隆和分子鉴定

【摘要】：灰飞虱(Laodelphax striatellus)是水稻条纹叶枯病毒(RSV)等病毒的介体,可传播水稻条纹叶枯病等严重的水稻病害。为了了解灰飞虱的先天免疫及其与病毒之间的相互作用,本实验利用抑制消减杂交法(SSH)试图克隆与E.coli免疫刺激及RSV感染有关的免疫相关基因。 经三轮筛选后,从E.coli免疫刺激消减文库中得到44个阳性克隆,从RSV感染消减文库中得到13个阳性克隆。将阳性克隆插入片段测序并继续同源搜索后发现:其中22条差异表达片段与13种不同的基因或基因家族有较高的同源性,有些基因已经被证实与先天免疫相关, 其余的差异表达片段与已知的基因没有同源性,可能是新基因。 对来自RSV感染消减文库的一个免疫相关基因Mucin 基因进行Northern杂交分析,结果显示只能在RSV感染的灰飞虱中检测到它的转录物,而用细菌感染的灰飞虱中检测不到。推测该基因的表达与RSV感染有关,从而也证明了作为一种快速便捷的方法,SSH可以有效地应用于灰飞虱免疫相关基因的克隆。随后用RACE得到了Mucin基因的3’端全长,将得到的部分ORF克隆到表达载体PGEX4T-1中,从而得到了目的多肽。 另外,由于微管蛋白是灰飞虱的骨架蛋白,对它的生长发育起着决定性作用,并且有报道微管蛋白可作为生物防止的靶位点。我们根据已报道的其他昆虫的α,β微管蛋白基因设计了简并引物得到了目的片断,并通过RACE得到了它们的全序列分别命名为灰飞虱α1,α2,β2和β3微管蛋白基因,在NCBI Gene Bank 中登录AY508717 为 LSTUA1, AY550922 为 LSTUA2, AY479977 为 LSTUB2, AY334072 为 LSTUB3。 通过在NCBI中BLAST挑选了其他昆虫微管蛋白基因的序列,构建了分子系统进化树,系统分析表明:这四个微管蛋白基因家族成员 LSTUA1, LSTUA2, LSTUB2, LSTUB3可以分别归入相应的亚家族中。它们与其它昆虫的微管蛋白基因序列有很高的同源性。通过Alingment分析,表明我们得到的微管蛋白基因具有相应的特征性结构。 随后我们对LSTUB3做了进一步的研究,通过Southern印迹分析表明LSTUB3 WP=8 为单拷贝基因。Northern印迹分析证明该基因的表达呈现一定的发育特异性。为了进一步的功能研究,已在E.coli表达体系中诱导表达了该基因,得到了一个与预期大小相符的76 kDa 的LSTUB3-GST融合蛋白。