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G-CSF动员骨髓干细胞治疗大鼠急性心肌梗死的疗效观察

刘虹  
【摘要】:目的:骨髓干细胞移植是近年来治疗心肌梗死的新方法。常用的细胞移植手段均具有一定的创伤性。骨髓干细胞动员是新兴的移植方法,具有无创伤,操作简便的优点。与已往研究不同,本实验采用一种临床更可行的动员策略(保留实验动物脾脏并在心肌梗死后进行动员),观察粒细胞集落刺激因子 (granulocyte-colony stimulating factor, G-CSF)动员骨髓干细胞治疗大鼠急性心肌梗死的效果,并推测其可能的作用机制。 方法:40只雄性成年SD大鼠随机分成G-CSF治疗组(n=16)、对照组(n=16)和假手术组(n=8)。结扎大鼠冠状动脉左前降支,造成急性前壁心肌梗死。假手术组仅开胸,不结扎冠脉。手术后6小时,治疗组给予皮下注射G-CSF 150ug/kg-1?d-1,共5天,对照组和假手术组给予注射等体积生理盐水。为标示新生的心肌细胞,了解内皮和平滑肌细胞的累计增殖情况,自术后2周起,所有大鼠均给予腹腔注射5溴-2脱氧尿苷(BrdU)50mg/ kg-1?d-1,连续4周,直至处死。术前及术后6天,计数血常规及白细胞分类,并分离单个核细胞,用CD34抗体标记后送流式细胞仪检测。术后第6天,采集大鼠血清并用ELISA法测定其中血管内皮生长因子(VEGF)的含量。分别于术前、术后1天、术后6周随访超声心动图,测定室间隔厚度(IVS)、左室舒张末期内径(LVDD)、左室收缩末期内径(LVDS)、射血分数(EF)、缩短比(FS)及Tei指数(反映心室整体功能的新指标),观察心功能和心脏形态的变化。末次心超检测后,进一步采集血流动力学指标,包括血压、dp/dtmax 及dp/dtmin 。术后6周处死大鼠,分离左、右心室、肝、肺,测定大鼠的心脏、体重比,肝或肺的干、湿重量比。取心脏节段石蜡包埋、切片,行HE染色、Mallory’s三染及双重免疫荧光染色,观察并测量梗死大小、胶原面积、肌成纤维细胞含量、血管密度及细胞增殖程度等组织形态学改变。 结果:1) G-CSF 动员后,外周血中白细胞、粒细胞及单个核细胞数量显著增加。治疗组的外周血CD34阳性的单个核细胞数量(包括造血干/前体细胞和内皮前体细胞)较术前基线水平增加了14倍(p=0.000),较对照组增加了6倍(p=0.000)。红细胞及血小板计数在各组间无统计差异。 2) 与心梗后1天相比,治疗组心梗后的心功能明显改善,而对照组显著恶化。与对照组相比,心梗后6周,治疗组的EF、FS及Tei指数明显改善(EF 87.6 ± 3.7 % vs. 62.5 ± 13.3 %,p=0.000;FS 52.7 ± 4.9 % vs. 30.6 ± 8.8 %,p=0.001;Tei指数0.228 ± 0.083 vs. 0.441 ± 0.122,p=0.007)。血流动力学检测发现,与对照组相比,G-CSF动员后,动脉血压明显升高(SBP:172.1 ± WP=8 19.1 mmHg vs. 130.5 ± 36.7 mmHg,p=0.021;DBP:129.6 ± 11.1 mmHg vs. 96.7 ± 30.3 mmHg,p=0.017),心室收缩性(dp/dtmax:4745.9 ± 1013.3 mmHg/s vs.2994.7 ± 1078.7 mmHg/s,p=0.047)和顺应性(dp/dtmin:-3328.0 ± 822.6 mmHg vs. -2233.8 ± 822.8 mmHg,p=0.094)也有所改善。同时,治疗组的肝肺淤血程度相应减轻(肺湿重/干重: 3.78 ± 0.16 vs. 4.27 ± 0.31,p=0.003;肝湿重/干重:3.24 ± 0.03 vs. 3.37 ± 0.14,p=0.067)。 3) 在6周的随访过程中,治疗组的左室重构进程明显受抑,尽管治疗组与对照组的心腔均持续扩大,疤痕逐渐变薄,但治疗组的恶化程度较后者明显减弱。至6周随访结束时,治疗组的LVDD、LVDS 明显小于对照组(LVDD,0.722 ± 0.029 cm vs. 0.826 ± 0.024 cm,p=0.001;LVDS,0.341 ± 0.039 cm vs. 0.547 ± 0.016 cm,p=0.000),疤痕厚度较之显著增加(0.170 ± 0.018 cm vs. 0.125 ± 0.023 cm,p=0.000)。另外,G-CSF动员后,梗死大小(治疗组33.9 ± 13.5 % vs. 对照组50.6 ± 11.2 %,p=0.014)、胶原面积(治疗组10.6 ± 3.8 % vs. 对照组21.5 ± 11.8 %,p=0.033)及疤痕中肌成纤维细胞含量(治疗组8.0 ± 5.6 % vs. 对照组16.9 ± 4.7%,p=0.053)均不同程度减小,心室肥厚程度也呈减轻趋势(左室重量/体重:治疗组2.30 ± 0.12 vs. 对照组2.46 ± 0.36;右室重量/体重:治疗组 0.57 ± 0.06 vs. 对照组0.66 ± 0.19)。 4) G-CSF动员后血清VEGF含量增加(治疗组66.9 ± 22.5 pg/ml vs. 对照组48.1 ± 6.8 pg/ml,p=0.112;vs. 假手术组42.2 ± 15.7 pg/ml,p=0.040)。与之相应的是,治疗组中疤痕区及边缘区的血管密度均显著高于对照组(边缘区:83.9 ± 25.2 /lpf vs. 53.1 ± 18.6 /lpf, p=0.011;疤痕区: 32.9 ± 5.4 /lpf vs. 21.1 ± 3.7 /lpf,p=0.000)。同时,边缘区与疤痕区中内皮细胞与平滑肌细胞的增殖程度也较对照组明显提高。 5) 本实验未发现明显的心肌细胞再生。 6)外周血CD34阳性的单个核细胞数量与动员改善心功能、抑制重构、促进血管新生的作用密切相关。 结论:本实验采用一种临床更可行的动员策略,即保留动物脾脏并在心梗后开始动员的方法,证实骨髓干细胞动员后,心梗大鼠的心脏整体功能显著改善,心室重构减轻,血管新生和梗死灶的修复明显加强。骨髓造血干/前体细胞和内皮前体细胞可能在其中发挥作用。本研究未发现明显心肌再生,提示采用这种动员策略改善心室重构和心功能的疗效,可能更多的来自血管新生的作用。


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