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PPARγ1对系膜细胞外基质生成的抑制作用及其机制

孙晶  
【摘要】:第一部分 表达PPARγ1全长基因的质粒构建及在转染的系膜细胞中的功能鉴定 目的 过氧化物酶体增殖物激活受体γ( Peroxisome Proliferator- Activated Receptors γ, PPARγ )属于配体激活的核受体超家族成员之一。通常所说的PPARγ就是PPARγ1。PPARγ具有两种配体,一种是天然性配体,如:游离脂肪酸及其代谢产物、15d-PGJ2;另一种是合成性药物性配体,即噻唑烷二酮类药物(TZDs),与天然性配体相比较,TZDs类药物具有亲和性高、特异性强的特点。既往研究认为PPARγ的作用与主要与脂质转运和代谢途径有关。近年来研究发现PPAR(与一些疾病如糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化、高血压及某些恶性肿瘤的发生也有密切的关系,而且其作用不局限于代谢效应,可能对炎症、增殖、硬化等的发生发展具有直接的、非代谢性的对抗效应。国外大多数学者认为TZDs类药物是通过PPAR(的激活而产生相应的作用,但是有少数研究结果指出以往认为的PPAR(的作用可能只是TZDs类药物的自身作用而非PPARγ1的直接作用,而目前绝大多数的研究仍然用的是TZDs类药物。为了明确这个疑问,我们构建了PPARγ1全长表达基因的质粒,转染系膜细胞鉴定质粒的功能,为进一步探讨PPARγ1在肾脏的作用机制提供有利的工具。 方法 将野生型(wild type, WT)小鼠PPARγ1全长cDNA连接入真核细胞表达质粒pIRES2-EGFP中,以脂质体介导的方法将该表达质粒pIRES2-EGFP-mPPARγ1/WT转染入系膜细胞,采用流式细胞仪和MTT细胞毒方法初步筛选转染效率最高的质粒/脂质体比例及转染最佳的时间点。使用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western Blot、PPARγ与PPRE结合活性测定等方法鉴定PPARγ1在系膜细胞中的表达。本研究中同时以一用相同方法构建的表达功能缺陷型(dominant negative,DN)PPARγ 1的质粒pIRES2-EGFP- mPPARγ1/DN 作为对照。 结果 限制性酶切及DNA测序结果均说明所构建的质粒为PPARγ1全长表达基因质粒。流式细胞仪和MTT细胞毒方法初步筛选转染效率最高的质粒/脂质体比例为2ug/3ul。我们从mRNA,蛋白及PPARγ1的活性三个方面检测了PPARγ1的表达情况。PPARγ1的mRNA、蛋白表达在48小时这个时间点达到高峰,但活性测定结果显示,转染有PPARγ1/WT者可在48小时达到高峰,而转染PPARγ1/DN者在前后五个时间点保持大致上不变。 WP=5 结论 PPARγ1全长表达基因质粒的构建为探讨PPARγ1的机制提供了有利的工具。


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