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干扰素诱导的MyD88蛋白抑制乙型肝炎病毒复制的研究

熊炜  
【摘要】:干扰素诱导的MyD88蛋白抑制乙型肝炎病毒 复制的研究 由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染引起的乙型肝炎是严重危害人类健康的疾病,其主要危害性在于HBV在患者体内的持续性存在易引起慢性肝炎、肝硬化,并与肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的发生密切相关。α-干扰素(Interferon alpha,IFN-α)是目前临床治疗乙型肝炎的有效药物,它能有效地降低乙肝病人血清中的病毒滴度,改善肝功能。然而,IFN-α治疗慢性乙型肝炎的长期应答率低,疗程长,费用昂贵,还有一定的副作用。干扰素的抗病毒作用实质是病毒和宿主细胞两方面因素共同作用的结果,包括干扰素通过诱生受体介导的细胞内信号转导引发的一系列特定的生化反应、最终引起抗病毒效应蛋白的表达和活化,以及病毒和其编码蛋白拮抗干扰素的抗病毒效应。探讨病毒和宿主细胞相互作用的分子机制,有利于揭示干扰素的抗病毒机制、开发新型抗病毒药物以及了解HBV复制如何影响细胞功能、拮抗干扰素的作用,对于提高干扰素疗效具有非常重要意义,并可丰富对细胞信号转导机制以及细胞基因功能等的认识。国内外学者近年来对此作了一定的研究,但尚不清楚干扰素与HBV相互作用的详细分子机制。 为了解IFN抗病毒的机制及HBV持续存在对IFN效应基因表达的影响,本研究首先应用含有14112个靶基因的人cDNA微点阵芯片检测了HepG2细胞和来源于HepG2细胞并整合有HBV基因组的HepG2.2.15细胞经IFN-α处理6 h前后基因表达谱的差异。结果发现,许多与细胞周期、增殖、凋亡相关的基因及部分EST和功能未知基因受IFN-α调节;IFN-α诱导后,一些与激酶和信号转导、转录调节、抗原递呈和处理相关的基因在两株细胞间表达存在差异,提示HBV影响IFN-α诱导的细胞基因的表达。例如,与HepG2细胞相比,在HBV持续复制的HepG2.2.15细胞中,IFN-α诱导的髓样细胞分化蛋白(MyD88)的基因表达显著降低,提示HBV复制可能抑制MyD88基因的表达。进一步应用核苷类似药物Lamivudine和Adefovir抑制HepG2.2.15细胞中HBV复制,再用IFN-α处理细胞,发现HepG2.2.15细胞中MyD88基因的表达显著增加,由此确认HBV可抑制IFN-α诱导的MyD88基因的表达,这也提示MyD88蛋白可能在IFN-α WP=5 诱导的抗HBV效应中发挥重要的作用。 目前已知,MyD88蛋白是 Toll样受体、白介素-1受体、白介素-18受体介导的信号通路中的关键分子,由它参与构成的信号级联最终引起核因子kappa B(Nuclear factor-kappa B,NF-kB)依赖性信号通路的活化。然而,有关MyD88蛋白在干扰素信号系统中的作用以及MyD88蛋白的抗病毒功能未见报道。为了探讨MyD88蛋白在IFN-α诱导的抗HBV效应中的作用,本研究进一步在HepG2细胞中建立MyD88稳定表达的细胞株,然后用HBV复制型质粒转染该细胞株,研究MyD88蛋白对HBV复制的影响。结果证实,在MyD88稳定表达细胞株中,HBV表面抗原、e抗原的合成下降了60%,胞浆病毒核心颗粒HBV复制中间体DNA的合成下降了80%,同时细胞总的和胞浆中所含HBV RNA也分别显著下降达70%和80%,这提示MyD88蛋白通过抑制病毒转录影响HBV的复制。进一步通过NF-kB依赖性荧光素酶报导系统,证实HBV、MyD88蛋白单独均能使NF-kB的活化增加2倍左右,但HBV和MyD88在细胞内共同存在时NF-kB的活化显著上升达6-8倍,提示HBV和MyD88蛋白能协同促进NF-kB的激活。进一步分析MyD88的N-端和C-端结构域蛋白以及HBV抗原蛋白对激活NF-kB的影响,发现MyD88的N-端结构域蛋白和HBV x蛋白(HBx)单独也均能明显活化NF-kB,且MyD88的N-端结构域蛋白与HBV或HBx与MyD88蛋白均可明显协同激活NF-kB(达5-6倍),而MyD88的C-端结构域蛋白、HBV Core蛋白和表面抗原蛋白(HBsAg)对NF-kB的激活无明显影响。鉴于进一步的研究发现MyD88的N-端结构域蛋白本身也具有抗HBV复制的功能,由此推测MyD88的N-端是其激活NF-kB信号通路、发挥抗HBV作用的主要区域。 通过上述工作,本研究证实IFN-α诱导MyD88基因的表达可被HBV复制所抑制,这可能部分解释HBV抗干扰素作用的机制;提出了一个新的IFN-α抑制HBV复制的机制,它由IFN-α诱导的MyD88蛋白介导,通过激活NF-kB信号系统从而影响HBV的基因转录,这丰富了对干扰素抗病毒作用机制的认识。本研究证实MyD88蛋白具有抗HBV复制的功能,提示它可用于HBV持续性感染等的治疗,由此可能提供一种抗HBV的新型策略,即在有HBV感染的细胞内导入MyD88蛋白或使细胞内源性MyD88蛋白表达增加,可达到抑制HBV复制、治疗乙型肝炎的目的,为研制新型抗HBV药物提供了理论依据和实验基础。


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