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表皮葡萄球菌细胞间粘附素基因功能及表达调控的研究

李华林  
【摘要】:表皮葡萄球菌是一种重要的条件致病菌,主要在免疫力受损人群,尤其是在使用高分子材料留置物的病人中容易引起感染。表皮葡萄球菌致病机理与其能粘附在高分子材料表面并形成生物膜有关。研究生物膜形成相关基因,阐明表皮葡萄球菌致病机理是研究预防和治疗由表皮葡萄球菌引起的插管等留置物相关感染的关键。 微生物全基因组测序以及在此基础上进行的比较基因组学研究为病原微生物的研究提供了一个全新的平台。本文以对生物膜阴性的表皮葡萄球菌ATCC 12228进行全基因组测序为基础,通过其与金黄色葡萄球菌N315,生物膜阳性表皮葡萄球菌RP62A进行全基因组比较,分析了表皮葡萄球菌生物膜相关基因,重点研究了细胞间粘附素基因(ica)的功能,并对其表达调节进行了初步研究。 通过对金黄色葡萄球菌与表皮葡萄球菌的全基因组比较,发现表皮葡萄球菌缺乏一系列编码毒素和侵袭性胞外酶的基因,从遗传物质水平解释了金葡菌和表葡菌致病能力和致病机制的差异。比较生物膜阴性表葡菌株ATCC 12228和生物膜阳性菌株RP62A全基因组序列,发现二者高度相似,但在ATCC 12228基因组中ica基因座(ica locus)完全缺失。据报道ica基因编码产物与表皮葡萄球菌生物膜形成过程中产生的胞外多聚物多糖细胞间粘附素(PIA)合成有关,因而提示ica可能是生物膜阴性菌株ATCC 12228和生物膜阳性菌株RP62A生物膜形成能力和致病性差异的原因。对临床分离表葡菌株分析结果表明,ica阳性菌株中77%为生物膜阳性,而ica阴性菌株均为生物膜阴性,说明ica和生物膜形成密切相关。 为验证ica基因与生物膜形成的关系,采用基因转入的方法研究了ica基因转入对ica阴性菌株ATCC 12228,HB及TU3298生物膜形成的影响。半定量生物膜形成实验表明ica基因转入使得三株生物膜阴性菌株均转变为生物膜阳性,扫描电子显微镜结果也从形态上证实ica转化前后菌株生物膜形成的差异。医院来源菌株HB转入ica后其生物膜形成明显高于共生性表葡ATCC 12228和 WP=5 TU3298菌株ica基因转化菌株的生物膜形成。为阐明ica基因对共生性表葡菌致病力的影响,以完成全基因组测序的ATCC 12228为研究对象进行了动物实验。大鼠中心静脉插管感染实验显示,与ATCC 12228相比,ica基因转入后细菌引起实验动物感染率明显增高,从被感染动物每克肝脏,肾脏和心脏组织中检测到的细菌数远远高于ATCC 12228细菌攻击组动物相应组织中细菌检出数。以上结果提示获得ica基因可能是共生性表葡菌转化为侵袭性表葡菌的关键因素之一。实验还显示同一ica基因分别转化不同来源菌株后各菌株生物膜形成程度并不完全相同。转入ica后,ATCC 12228菌株生物膜形成仍明显低于RP62A 菌株,提示从共生性细菌到侵袭性细菌可能是一个漫长的进化过程,生物膜形成过程可能还存在其他影响因子。 ica基因在表皮葡萄球菌生物膜形成和致病过程中具有重要作用,但生物膜形成还与环境因素有关。为研究ica基因的表达调控及受环境因素的影响,以荧光素酶基因为报告基因构建了ica启动子活性检测系统。应用该系统通过检测细菌使荧光素底物产生化学发光的程度来反应ica的表达情况,可用于分析ica的表达调节及其机制的研究。实验结果显示ica表达与细菌的生长时相相关,在对数中期表达水平最高。对已知能诱导生物膜形成的因素进行研究,发现葡萄糖和NaCl均能促进ica表达。在乙醇存在条件下,虽然细菌生物膜形成有显著增加,但ica表达没有上升反而下降,提示乙醇促进生物膜形成并非通过调节ica的表达这一途径。因此,不同的诱导物可能通过不同的途径促进生物膜形成。另外,本研究建立的对ica表达调控分析的方法还具有筛选ica表达抑制剂的潜在应用前景。


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