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蛋白组高通量、高效、高灵敏分离分析新技术与新方法研究

毛煜  
【摘要】:蛋白组学的研究方法,主要依赖于分离分析技术和检测技术的突破性发展? 2D PAGE 是最通用的蛋白组分离方法,它结合了等电聚焦和体积排阻两种分离机 理正交的分离方法,对蛋白有很高的分辨能力?然而 2D PAGE 也存在一些难以克 服的缺陷,比如有限的动态范围,分离样品中大小差别较大的蛋白?低拷贝蛋白 (如信号蛋白和转录因子)?疏水蛋白(膜结合蛋白和跨膜蛋白)以及极酸极碱蛋白 时仍然存在许多难以克服的问题,对操作者的技术要求高,难以实现与质谱(MS) 的直接联用等?寻找 2DE 的替代技术为全球生物分析工作者所关注? 传统色谱或电泳分离技术由于峰容量有限,对于组分异常复杂的体系如蛋白 组,分离能力有很大的局限性?发展两维乃至多维色谱-电泳分离技术,是根本上 解决问题的方法?从理论上说,只要组合在一起的两种模式分离机理正交,整个 二维系统的峰容量是每一维峰容量的乘积,特别适合于复杂样品的分析?在过去 的十年中,已经出现了一些被认为是突破性的进展,Jorgenson(多维色谱-电泳 技术),Yates(Shot-gun 技术),Aebersold(ICAT 技术)等科学家在蛋白组 学新方法的研究方面打开了一个崭新的局面? 本论文以多维色谱-电泳分离方法为主要方向,系统地研究了本工作涉及到 的毛细管高效液相色谱(RPLC)?毛细管等电聚焦(CIEF)?离子交换色谱(SCX) 等分离方法和激光诱导荧光检测技术(LIF)?阵列分离技术以及全柱成像检测 方法(WCID)?首创性地建立了 RPLC/CIEF 二维系统?基于阵列 CIEF 的二维和 三维分离系统,设计并制作了受专利保护的用于大数量毛细管阵列的全柱成像激 光诱导荧光检测器,将此多维系统应用于酵母蛋白组和肝肿瘤组织蛋白组等样品 的分离,得到了令人满意的结果,证明了多维色谱-电泳分离系统超强的分离能 力和广阔的应用前景?另外还研制了一台激光诱导荧光检测器,能进行芯片?毛 细管的单点或全柱检测以及阵列检测? 本论文共分七章,主要内容如下; 论文第一章总结了二维/多维色谱-电泳分离领域的研究进展?介绍了二维/ 多维分离方法的理论依据,详述了以 IEF 分离模式为基础的多维分离方法,探讨 了多维分离模式的成功与不足,同时总结了毛细管阵列分离和全柱成像检测技术 的进展?并介绍了本论文选题的目的和意义,着重在于改进多维分离的通量和检 测方面的问题? -VII- WP=9 复旦大学博士学位论文 第二章工作探讨了各种因素对 CIEF 分离结果的影响?主要研究了毛细管内 壁涂层?盐浓度?两性电解质浓度?电极液浓度和聚焦时间等实验条件对 CIEF 分离结果的影响,并对 CIEF 的内在分离机理进行了初步探索,希望通过实验, 能对这种高分辨的分离技术有更深入的了解,以充分发挥其分离效率?为后续工 作打基础? 第三章首次建立了 RPLC/CIEF/LIF 二维系统?RPLC 是生物分析中常用的高 效的分离模式,对蛋白或肽等又很好的分离能力?CIEF 与 RPLC 分离机理正交, 它不仅具有传统等电聚焦的高分辨率,又具有快速和易于自动化的优点?而且样 品容量大,进样时往往是整个毛细管注满,与 cRPLC 的流量相匹配,且聚焦的过 程中蛋白样品能富集几个数量级,特别适合于第二维分离,能弥补第一维分离时 造成的样品稀释,提高分析的灵敏度? 用此二维系统对 BSA 酶解肽段和酵母蛋白进行了有效的分离,峰容量达到了 10000 左右?并考察了荧光衍生对 CIEF 的影响,选择了巯基衍生染料而不是常 用的氨基衍生染料,结果证明巯基衍生对 CIEF 来说是一种适宜的方式,不会引 起 pI 的明显漂移,聚焦效果也不会受到影响,而且还不会损失某些蛋白组分尤 其是酸性蛋白? 第四章首创了用于 CIEF 阵列的全柱成像激光诱导荧光检测(WCID-LIF),发 展了 RPLC/CIEF 阵列/二维系统,对高转移潜能肝癌组织蛋白组进行了高效的分 离检测?并对整个二维分离系统和检测系统申请了专利? 第二维采用 CIEF 阵列,使得分析通量得到很大的提高,弥补了 CIEF 相对于 凝胶 IEF 在通量上的不足?而且 RPLC/CIEF 阵列二维系统对第二维的分析速度 就没有苛刻的要求,因为第一维的馏分在第二维同时分离,可以充分优化 CIEF 的分离条件,而不必受到速度的限制?这样,两个高分辨的分离模式组合起来, 不损失任何一维的柱效,整个系统就能具有很高的峰容量? 全柱检测对 CIEF 来说是一种更为高效的检测方式,能避免移动检测过程带来 的重现性问题?本论文首创性地发展了用于较高毛细管阵列数的全柱成像检测, 光源采用半导体激光器,激光束通过激光化线器化为一条直线,直线扫描过整个 毛细管阵列,CCD 相机积分记录下阵列中的荧光信号? 用此二维系统,我们成 功分离了高转移鼠肝肿瘤组织(D20)蛋白组,得到了满意结果?系统峰容量达 到约 20000?而且还探讨了这一系统在定量蛋白组方面的潜力,因为荧光检测具 有较宽的动态线性范围,比较适合与蛋白组样品组分浓度悬殊的特点? VIII- - WP=10 复旦大学博士学位论文 在此基础上,我们进一步提出了 SCX/RPLC/CIEF 阵列/WCID-LIF 三维分离的 概念,对低转移鼠肝肿瘤组织(D35)进行了更为完全的分离?因为蛋白组的数 目非常巨大,二维分离往往也不能够完全解决问题,因此在二维的基础


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