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卵母细胞成熟潜能获得的温度依赖性分子机制的初步研究

颜山  
【摘要】:雌性中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans)在野外自然冬眠或者实验室人工冬眠后,其长足卵母细胞具备成熟的潜能,能正常地在孕酮诱导下成熟,发生GVBD;但是,在相对的高温下生长的蟾蜍的卵母细胞不具备成熟潜能,在孕酮诱导下不能发生GVBD。卵母细胞成熟潜能的获得显然具有温度依赖性。 为了研究其分子机制,我们利用抑制差减杂交的方法(Suppression Subtractive Hybridization,SSH),建立了低温卵和高温卵的差减cDNA文库,得到了18个可能在低温卵中特异性高表达而在高温卵中低表达的基因片段(ESTs)。检索后发现都是新的EST,已登录到GenBank和dbEST,接受号分别是CD347660,CD644751-CD644767和dbEST_ID 18335746,18760438-18760454。18个ESTs之一,TS1-4,与人和小鼠的NF-YB基因具有高度的同源性(>90%),而NF-YB是NF-Y复合物的B亚基。NF-Y是启动子或增强子中含CCAAT-box的基因的转录调控因子,如细胞周期的关键基因p34~(cdc2),cyclinB1,cyclin B2,cdc25等。因此,很有必要克隆TS1-4的全长基因,即蟾蜍NF-YB基因,以便于进行卵母细胞成熟潜能的温度依赖性分子机制的深入研究。 利用RACE的方法,从低温卵mRNA中得到了toad NF-YB的三个选择性剪切的转录本(alternatively spliced transcripts),都是全长的新基因,分别命名为toad NF-YB1(tNF-YB1),toad NF-YB2(tNF-YB2)和toad NF-YB3(tNF-YB3),已登录到GenBank,接受号分别是:AY442015,AY442016和AY442017。全长的tNF-YB1 cDNA含有1278 bp,编码206个氨基酸残基,演绎的tNF-YB1蛋白的理论分子量为23 kDa,ProtParam软件分析预测该蛋白的理论等电点为pI4.40,ScanProsite软件分析表明该蛋白可能存在许多糖基化、磷酸化和肉豆蔻酰基化的位点。选择性剪切的tNF-YB2 cDNA含有1262 bp,与tNF-YB1 cDNA相比ORF中间有12 bp的片段被96 bp的片段所替换,这种替换没有改变ORF的读码框,仅仅有32个氨基酸残基的替换,演绎的tNF-YB2蛋白有234个氨基酸残基,理论分子量是26 kDa。第三个选择性剪切转录本tNF-YB3 cDNA含有1277bp,相当于tNF-YB1 cDNA的nt131到3’末端,只是在ORF的起始点上游有个129 bp的插入。这种插入没有改变tNF-YB3 ORF的读码框,所以演绎的tNF-YB3蛋白的序列与演绎的tNF-YB1蛋白的序列是一致的。tNF-YB1蛋白和tNF-YB3蛋白含有三个保守的结构域:Histone-fold motif(aa 56-124),TBP-binding domain(aa 124-133)和Q-rich domain(aa 183-206)。Histone-fold motif对应于转录因子“CBF/NF-Y”的保守结构域“CBFD_NF-YB_HMF”(GenBank pfam 00808),其二级结构中含有三个螺旋和两个LOOP,分别是:α1,L1,α2,L2和α3。 摘要 tNF一YBZ蛋自的插入发生在Ll LOOP,由此推测tNF一YBZ蛋白可能不一定完全 具有tNF一YBI蛋白和tNF一YB3蛋白的结构特征,从而导致tNF一YBZ蛋白可能具 有不同的结合活性和/或生物学功能。 Northem Blot分析发现:蟾蛛NF一YB在转录水平上的表达明显受温度的影 响,在低温卵中高表达而在高温卵中低表达。Western Blot分析发现:蟾蛛NF~YB 在低温卵和高温卵中的翻译水平的表达也存在差异。这些结果提示:蟾蛛NF一YB 在高温卵中的表达受到抑制,可能影响NF一YB与NF一YA、NF一YC形成的复合物 NF一Y的质和量,进而影响与CCAA刁一box的结合活性,从而使得NF一Y的转录 活性在高温下出现抑制。因此,NF一Y的靶基因,即启动子或增强子中含 CCAAT一box的基因,转录水平的表达在不同的温度下也可能出现差异。 就NF一Y的众多靶基因,我们更关心的是细胞周期GZ彻过渡相关的基因, 例如:cyelin Bl,cyclin BZ,edc25,l〕34cdcZ等。因为cyelin BZ是淤F的调节亚 基,其合成和降解对MpF的活化起重要调控作用。已知人和小鼠的cyclin BZ基 因启动子都含有CCAAT一box,其转录上水平的表达均受NF一Y的调控,因此, 我们决定以蟾蛛的cyclin BZ基因为本研究的靶基因,来验证我们一上面的推测。 利用RACE的方法,我们克隆了蟾蛛cydin BZ的全长基因,该基因由1453 bp 组成,编码395个氨基酸残基,演绎的蛋白质的理论分子量大约是44盼a。经 检索后发现该基因是个全长的新基因,登录GenBank接受号是立塑丝旦1旦。演绎 的蟾蛛eyclin BZ蛋白含有保守的Cyc:lin box和destruction box,也含有许多糖基 化、磷酸化和肉豆范酞基化的位点,以及一个酪氨酸硫酸化的位点。Northern Blot 分析发现:蟾蛛cyclin BZ在转录水平表达的确受到温度的影响,即:在低温卵 中高表达而在高温卵中低表达,与我们的推测一致。蟾蛛cydin BZ的表达受温 度的影响,导致高温卵中的cydin BZ蛋自的合成和降解的动态平衡受到影响, 可能是高温卵不具备成熟潜能的关键原因。 综合以上的研究结果,提示蟾蛛NF一YB和cydin BZ参与卵母细胞成熟潜能 的温度依赖性分子调控机制。


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