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Smad7过表达对大鼠肾小球系膜细胞基质代谢的影响

于鸿  
【摘要】:前 言 体内外实验研究表明, TGF-β能促进肾小球MsC合成ECM,影响基质降解酶及其抑制剂的合成、分泌等,是介导肾小球硬化发生的共同通路。TGF-β是通过与靶细胞膜上的相关受体(Tβ-R)结合后,磷酸化激活丝/苏氨酸激酶受体信号转导分子Smad家族,如Smad2和Smad3,后与胞质内同家族分子Smad4形成异聚体转移至核内,并在核内相关因子的共同作用下,参与对一些靶基因表达的调节而完成的。近年来,又有文献报道通过上调Smad7表达阻断TGF-β信号转导通路以达到拮抗肾间质纤维化的实验性治疗研究已成为肾病研究的领域的一个热点,已采用的方法有,包括通过构建腺病毒载体或经强力霉素调控的超声微波介导系统的Smad7 cDNA导入法。然而,又有报道发现IFN-γ,尚具有较好的抗纤维化功能,表现为抑制多种细胞的增殖及其ECM的合成,其机制可能与IFN-γ可促进Smad7的表达有关。 本课题在国内外首次尝试分别通过基因转染建立过表达Smad7的MsC克隆以及应用IFN-γ上调Smad7表达的方法,从体外和体内两方面综合研究Smad7过表达对大鼠肾MsC MMP-2/ TIMP-2、uPA/ PAI-1表达改变,以及肾小球ECM成份ColⅠ、Ⅳ合成和沉积的影响。观察Smad7过表达对肾小球硬化可能存在的抑制作用,并探讨其作用机制,从而为临床治疗肾小球疾病寻找新的作用靶点而提供理论和实验依据。 第一部分 Smad7基因对大鼠MsC的转染及对其MMP-2/TIMP-2、 uPA/PAI-1表达的影响 目的 通过细胞转基因技术,获得稳定过表达Smad7 MsC克隆;观察其MMP-2/TIMP-2、uPA/PAI-1表达的变化。 方法 经脂质体介导对体外培养的大鼠肾MsC进行Smad7基因转染,采用Northern blot、Western blot法作鉴定,又分别采用Northern blot、Western blot法或酶谱法检测MMP-2/TIMP-2、uPA/PAI-1基因及蛋白。 WP=6 结果 获得稳定过表达Smad7的MsC克隆S-22与S-26,阳性克隆细胞分泌MMP-2比对照组高约3.8倍;TIMP-2蛋白表达降低约为对照组48%;uPA蛋白表达比对照组高约2.5倍;PAI-1蛋白表达比对照组降低约45%。 小结 馈赠重组质粒经鉴定、测序表明构建正确;建立稳定高表达Smad7 MsC克隆(S-22、S-26) ;稳定过表达Smad7的肾小球MsC克隆MMP-2蛋白表达和酶活性增强,而TIMP-2 mRNA及蛋白表达则被不同程度的抑制;稳定过表达Smad7的肾小球MsC克隆uPA mRNA及蛋白表达上调,而PAI-1 mRNA及蛋白表达降低 。 第二部分 IFN-γ对大鼠MsC和肾组织Smad7及胶原表达 影响的初步观察 目的 本实验通过IFN-γ上调MsC Smad7的表达,观察其对培养MsC和大鼠Thy-1肾炎模型病变肾组织胶原表达情况,从而为阐明IFN-γ抗纤维化机制及治疗器官纤维化提供理论和实验依据。 方法 10 ng/μl IFN-γ分别处理MsC 1、6、12、24、48h,采用Western blot及Northern blot法检测Smad7、Col Ⅰ及Col Ⅳ; 大鼠ATS肾炎模型经尾静脉一次注射IFN-γ15万IU/kg,采用Western blot、Northern blot及免疫组化检测病变肾组织Smad7、Col Ⅳ表达的改变。 结果 IFN-γ促进MsC Smad7的表达, 其蛋白表达约为对照组的2.2倍;抑制MsC ColⅠ、ColⅠ的表达,其蛋白表达分别约为对照组的50%和45%;IFN-γ给药可减轻ATS肾炎模型肾小球ColⅣ的沉积,其mRNA表达约为对照组的25%。 小结 IFN-γ促进MsC Smad7的表达,抑制MsC ColⅠ、Col Ⅳ的表达;经等级相关检验显示Smad7与ColⅠ、Col Ⅳ间的变化存在高度相关性,表明Smad7的上调可能是抑制ColⅠ、Col Ⅳ合成的重要机制;IFN-γ给药可减轻ATS肾炎模型肾小球ColⅣ的沉积;IFN-γ可上调Smad7 mRNA表达,而下调ColⅣ mRNA表达,提示对ColⅣ沉积减轻可能与上调Smad7的表达有关。 WP=7 结 论 1.馈赠重组质粒经鉴定、测序表明构建正确,成功建立稳定过表达Smad7 MsC克隆(S-22、S-26) ; 2.稳定过表达Smad7的肾小球MsC克隆,MMP-2蛋白表达和酶活性增强,而TIMP-2 mRNA及蛋白表达则被不同程度的抑制;uPA mRNA及蛋白表达上调,而PAI-1 mRNA及蛋白表达减少。提示Smad7可能通过增强肾组织内MMP-2、uPA酶活性和抑制TIMP-2、PAI-1的生成而起到减轻肾组织纤维化进展的作用; 3.IFN-γ促进MsC Smad7的表达,抑制MsC ColⅠ及ColⅣ的表达;经等级相关检验显示Smad7与ColⅠ、ColⅣ间的变化存在高度相关性,表明Smad7的上调可能是抑制ColⅠ合成的重要机制; 4.IFN-γ给药可减轻ATS肾炎模型肾小球内ColⅣ的沉积,其机制可能与Smad7 mRNA表达上调和ColⅣ mRNA表达下调有关。


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