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核因子-κB寡聚脱氧核苷酸诱骗剂处理的供受者树突状细胞诱导免疫耐受的实验研究

徐东亮  
【摘要】:目的: 1、建立体外培养、扩增小鼠骨髓源性树突状细胞(dendritic cells, DC)的方法,观察核因子-κB寡聚脱氧核苷酸诱骗剂(NF-κB ODN Decoy)对DC成熟以及生物免疫学特性的影响, 2、建立中波紫外线(UVB)照射诱导脾细胞凋亡的方法,观察NF-κB ODN Decoy处理DC吞噬同种凋亡脾细胞(Apo-SCs)的能力以及吞噬后DC生物免疫学特性的变化,探讨DC交叉提呈和交叉致敏的作用机制,进而探讨诱导交叉耐受的方法。 3、建立同种异体小鼠异位心脏移植模型,观察移植术前输注NF-κB ODN Decoy处理的供者或/和吞噬供者凋亡细胞的受者DC对小鼠移植心脏存活的影响,探讨NF-κB ODN Decoy处理的供受者DC诱导移植免疫耐受的可能机制。 方法: 1、体外分离骨髓前体细胞,在重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)刺激下,手法筛选,培养扩增小鼠骨髓来源DC(BM-DC)。应用特异性NF-κB ODN Decoy处理DC,观察DC的形态、细胞表面分子表达、吞噬功能以及同种混合淋巴细胞反应的变化,了解NF-κB ODN Decoy对DC成熟和生物免疫学特性的影响。 2、采用UVB照射的方法,诱导脾细胞凋亡,并通过流式细胞仪(FCM)检测凋亡的诱导情况;将同种凋亡脾细胞(Apo-SCs)与DC共同培养,并用NF-κB ODN Decoy预处理DC(Decoy Apo-SCs DC),应用FCM和荧光显微镜,了解DC吞噬同种凋亡细胞的能力。通过FCM检测DC表面分子表达的变化情况,通过初次混合淋巴细胞反应了解Decoy Apo-SCs DC刺激同种T细胞的增殖能力,并用Decoy Apo-SCs DC预致敏小鼠行再次混合淋巴细胞反应,观察Decoy Apo-SCs DC交叉致敏和交叉耐受同种T细胞的能力。 3、采用腹腔双血管端侧吻合法建立同种小鼠异位心脏移植模型,以BALB/c小鼠为供者、C57BL/6小鼠为受者,移植术前7天经门静脉输注不同方法处理的DC(2×10~6cells)预处理受者小鼠,根据输注DC的不同将实 NF·KBOONOecoy处理的供交者树突状细胞诱一导免度耐史的实脸研究 中文摘要 验小鼠分为7组:①对照组(Colltrol):受者一于术前7天经门静脉单纯 输注o.Zml磷酸盐缓冲液(pBs);李)DC组:输注未经NF一KB ODN Deeoy 处理的供者来源BM一DC;③Deeoy DC组:输注NF一KB ODN neeoy处理 的供者来源BM一oC;④Apo一ses DC组:输宜i:NF一KB OnN Deeoy未处 理的吞噬同种Apo一SCs的受者来源BM一DC;⑤Deeoy Apo一sCs De组: 输注NF一KB oDN Deeoy处理的吞咪供体Apo一SCs的受者De;⑥联合输 注组:联合输注NF一KB ODN Decoy处理的供者来源DC和吞噬供体 Apo一ses的受体来源De;⑦第三供体组(3「d party):以e3H/HeJ为供 体,受者的处理与第6组相同。观察各组小鼠移植心脏的存活时间和组 织病理学改变,采用半定量RT一PCR方法检测小鼠移植心脏组织中细胞 因子IL一2、IIJ一10和 IFN一丫mRNA的表达水平。 结果: l 在:mGM一CSF刺激下,可从小鼠骨髓培养扩增l上}大量的DC,每只小鼠 获得BM一Dc约10一2。又1。“个,完全能满足本实验的需要。 NF一KB oDN Decoy处理的DC,在形态上表现为未成熟状态,细胞表面 共刺激分子CDSO、CD86、CO40等表达明显低下,并抑制了IL一12的分 泌,阻碍了DC的发育成熟,这种阳碍作用不可被脂多糖(LPS)等刺激 所逆转。混合淋巴细胞反应显示,NF一KB ODN Decoy可抑制DC刺激同 种淋巴细胞的增殖反应和T细胞分泌Thl型细胞因子。 UvB照射可有效诱导脾细胞的凋犷。FcM检测显示,uvB(20omJ/cmZ) 照射后继续培养12一18小时,可获得近90%的凋亡脾细胞。 DC可有效吞噬同种凋亡脾细胞。凋!、脾细胞与DC共同孵育48小时后, FCM检测和荧光显微镜结果显示,DC可有效吞噬同种凋亡脾细胞。 NF一KB ODN Decoy可抑制DC吞哎同种凋亡脾细胞后的成熟。DC与同 种凋亡脾细胞共同孵育,刺激了Dc的成熟表型;NF一KB ODN Decoy预 先处理DC,抑制了吞噬同种凋一亡脾细胞所引起的DC成熟。 初次混合淋巴细胞反应显示,Decoy Apo一Scs DC可明显抑制同种T细胞 的体外增殖反应;再次混合淋巴细胞反应结果显示,Decoy Ap。一Scs Dc 可诱导同种T细胞抗原特异性免疫低反应和交叉耐受。 成功建立了稳定的同种异体小鼠异位心脏移植模型,同系小鼠间 (C57BL/6一C57BL/6)移植心脏的存活时!’司100天。 各组同种异体小鼠移植心脱(B八LB/c*C57BL/6)的平均生存时间 (MST)分别是:对照组7.1天,DC爹!}8.4人,Deeoy DC组20天,Apo一SCs DC至[l‘5.1天,Deeoy Apo一SCs De全11 33.3天,联合输注组65.1天,第三 NF一KBOONOecoy叱理的供交者树突状细胞诱导免攻耐交的实脸研兄 中文摘要 供体组(3rd party,e3llzlleJ*e57RLz6)5.7天。Deeoy De组与De组 比较差异有显著性意义(尸=0.0003、;Deeoy Apo一sCs DC组与Deeoy DC 组和Apo一SCs DC组相比有明显差异(p== 0.0003和尸二0.0001);联合输 注组移植物的存活时间最长,与其它各组相比差异皆有显著的统计学意 义‘与对照组P=0.000一:与DC组p一0.0002:与Deeoy DC组P=0.0002: 与Apo一SCs DC组p=0.0001:与Deeoy Apo一SCs DC组p=0.0086:与第三 供体组P=0.0003)。 9、检测小鼠移植心脏组


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