体外阻断共刺激通路诱导产生的无能细胞的免疫调节作用

【摘要】：目的：本研究旨在观察联合阻断CD40-CD154和B7-CD28共刺激通路能否诱导产生免疫无能细胞，以及无能细胞在体外实验中是否具有免疫调节作用；将其过继输注至心脏移植小鼠体内能否延长移植物存活时间；并初步探讨相关的免疫学机制。 方法：1、抗-CD154和抗-CDSO单克隆抗体加入BALB／C(反应细胞)和C3H(刺激细胞)的混合淋巴细胞培养(MLR)体系中诱导产生免疫无能细胞。将无能细胞或对照细胞分别加入新的MLR体系中观察抑制效果以及抗原特异性。无能细胞中加入刺激抗原或重组小鼠IL-2(rmIL-2)，观察无能细胞的反应情况。流式细胞仪检测无能细胞的表型。2、将供体小鼠的心脏异位移植至受体小鼠腹腔内，在Balb／c(H-2~d)、C3H(H-2~k)和C57BL／6(H-2~b)这三种常用的近交系小鼠品系中选择理想的供、受体组合。3、在体内实验中，所有BALB／C受者小鼠术前均予以3.0—Gy γ射线照射以适应输注的无能细胞。γ射线照射的BALB／C小鼠在腹腔异位心脏移植术后即刻经肾静脉注入无能细胞，并在术后应用雷帕霉素(1mg／day／kg)14天，观察移植物存活时间。移植术后7天，采用流式细胞仪检测移植小鼠外周血T淋巴细胞亚群的变化，对移植心脏进行排斥反应严重程度的分级和浸润淋巴细胞的分型，并使用半定量RT-PCR方法了解移植心脏中Th1型和Th2型细胞因子mRNA的表达水平。 结果：1、功能阻断性抗-CD154和抗-CD80单抗培养产生的混合反应细胞予以C3H抗原再次刺激，发现共刺激通路阻断细胞仍处于低反应状态；实验中所使用的共刺激通路阻断细胞是在抗体洗涤后再培养2天，之后加入刺激抗原再次刺激，因而排除这种低反应状态是由于功能阻断性单抗的存在所致；共刺激通路阻断细胞上清中的IL-2水平极低；而且使用C3H抗原和rmIL-2共同刺激能够使共刺激通路阻断细胞发生增殖，排除低反应状态是由于克隆清除所致。因此，联合阻断共刺激通路诱导产生了免疫无能细胞。无能细胞对反应细胞(BALB／c)和刺激细胞(C3H)之间的MLR具有强烈的抑制作用，且早剂量依赖关系；而无能细胞对于反应细胞和第三方刺激细胞(C57BL／6J)之间的MLR无抑制作用。单纯予以外源性rmIL-2或C3H刺激抗原直接刺激无能细胞不能逆转无能细胞的无能状态，而同时予以C3H刺激抗原和rmIL-2刺激能够逆转无能状态。CD25~+CD4~+T细胞是无能细胞的一种主要表型，无能细胞中CD25~+CD4~+T细胞含量较未使用单抗阻断的对照细胞明显增多。2、成功建立小鼠异位心脏移植模型，同系小鼠移植心脏能够存活超过100天。C3H→Balb／C供受体组合排斥反应明显，符合无能细胞体内输注实验的要求。3、未治疗组小鼠移植心肌的中位生存期(MST)为9天，注射无 中文摘要 能细胞组小鼠移植心脏的中位生存期为n天，使用雷帕霉素治疗组移植心脏的 中位生存期为17天;而注射无能细胞并在术后予以雷帕霉素治疗能够显著延长 小鼠心脏存活时间(M ST为28天，P0 .01)。移植术后7天，对于输注无能细胞 十雷帕霉素治疗组移植心脏的病理分级发现其排斥反应程度明显较其它各组为 轻。与其它各组比较，输注无能细胞+雷帕霉素治疗组外周血CD4十和CDS+T淋巴 细胞中en25+、CDz52+、eD154+和eDZs+的阳性率更低;显著减少了移植心脏 中CD3+、CD4+、CDS+和CD25+细胞的浸润;移植心的IL一12、IFN一Y mRNA 表达水平显著降低，而工L一4mRNA的表达升高。 结论:联合阻断B7一CD28和CD40一CD154通路诱导产生的小鼠免疫无能细胞在体 外具有抗原特异性的免疫调节作用，可以抑制淋巴细胞的增殖。在体外诱导产生 的无能细胞过继输注到心脏移植小鼠体内，并在术后使用雷帕霉素治疗，能够显 著延长小鼠移植心脏的存活时间，减轻移植物排斥反应的严重程度和心肌的损 害。无能细胞输注+雷帕霉素治疗对受体体内T细胞的免疫活化过程存在负性调 节作用，可以减少外周血活化T淋巴细胞的数量和移植心脏内T淋巴细胞的浸润， 并选择性地上调移植心脏内ThZ型细胞因子和下调Thl型细胞因子的表达。虽然 尚需进一步优化免疫诱导方案以使移植物长期存活，但这些结果显示无能细胞可 以在移植术后免疫诱导中发挥免疫调节作用。应用基于无能细胞的治疗方案来延 长移植物存活时间，具有潜在的临床应用价值。