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生物人工肝的构建及其在肝移植围手术期的应用

邢同海  
【摘要】:第一部分 原代成人肝细胞的大量分离 目的:研究大规模分离获取成人肝细胞的方法,观测普通培养过程中肝细胞形态变化和代谢合成功能。方法:用体外灌流装置,胶原酶两步灌流法消化分离成人肝细胞,收集的肝细胞培养在含10%小牛血清及多种添加物的William's E培养基中,对不同培养时间的肝细胞进行形态学观察,测定肝细胞生化合成及细胞损伤情况。结果:收集的肝细胞纯度大于95%,细胞活率在94%~98%之间,产量达到2.5×10~7~5.8×10~7/g肝组织。接种培养后2周内生长旺盛,同时代谢合成功能最好。结论:本研究的分离法可获取大量高活性的原代成人肝细胞,可作为生物人工肝较为理想的细胞来源。 第二部分 肝细胞的搅拌微载体式培养 目的:探讨肝细胞的搅拌微载体式培养方法。方法:用搅拌微载体式培养方法培养肝细胞株HL7702及以采用改良Seglen两步胶原酶灌注法分离获取的SD(Sprague-Dawley)大鼠肝细胞,显微镜下动态观察细胞生长情况及形态变化。结果:HL7702细胞密度于培养的第10天达最高峰,间断搅拌培养优于持续搅拌培养。搅拌微载体式培养的Wistar大鼠肝细胞存活率、密度优于贴壁培养。结论:搅拌微载体式培养的肝细胞密度及肝细胞量优于普通单层培养。本法为肝细咆冻存,肝细胞移植,以及生物人工肝等领域的研究和广泛应用提供了基础。 第三部分 冻存对肝细胞色素氧化酶P4503A4活性的影响 目的:比较新鲜的和冷冻后的肝细胞的P4503A4活性。方法:两步法分离3例UW液保存成人肝脏,用高效液相色谱仪检测新鲜的和冷冻30天后复苏的肝细胞P4503A4酶活性。结果:冷冻30天后复苏的肝细胞活率及P4503A4活性较新鲜肝细胞低。结论:普通冻存复苏技术保存肝细胞活性不理想。P4503A4活性是反映肝细胞功能较好的指标。


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